【求助】求蛋白分离建议

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标题:【求助】求蛋白分离建议

nikonun[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近分离一融合蛋白，N端GST， C端histag，分子量100K左右，蛋白自身是个DNA结合蛋白.
裂解时，用的buffer常规Ni柱分离裂解液，含600mM NaCl, 高盐防止结合DNA.
走了三步
1/ NiNTA分离
2/MonoS离子交换 A: 20mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM DTT B: A+2M NaCl
3/Superdex75
问题是杂质带还是太多，杂质与100K的蛋白纠缠在一起。曾经试过在NiNTA分离后，再试GST分离，但结果差不多。
请问有何好建议去除杂质带?
SDS-PAGE中，靠分子量数字的一列为蛋白标准。

nikonun[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1/ NiNTA分离

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2014-6-10 11:16

18878089.jpg (16.61 KB)

nikonun[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

MonoS离子交换

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2014-6-10 11:17

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nikonun[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

3/Superdex75

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2014-6-10 11:17

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flower-201[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你用Mono S是阳离子柱吧，pH8.0能结合得上么？都流穿了吧。
单用Ni柱效果都可以很好的，关键是你要舍得用很多起始 buffer冲，我一般用500 mM NaCl, 25~50 mM imidazole, 一般冲它几十个柱体积。如果有流动紫外，可以检测冲到buffer基线。

nikonun[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1/pH 8.0时， Mono S能结合我的蛋白。 MonoQ 下的杂质带更多，所以才试了Mono S。
2/冲它几十个柱体积?倒没试过，我一般冲十个柱体积。这可以试一试。但我这里的试剂比较生猛，imidazole用上50 mM，目标蛋白一般有很多的洗脱。我的起始 buffer一般含imidazole10 mM.

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发表于 2014-6-10 11:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哦？
那你的目的蛋白是在盐浓度多少被洗脱的？我还是觉得可以调低一些pH值，结合上之后再用缓一点的梯度洗脱。
Ni柱我用的感觉是上样量很大，我摇1l菌，只要2-3ml胶就可以完全结合，所以你可以试试加大上样量，起始buffer不要怕会洗下目的蛋白，his-tag结合还是很牢的，就算有一点被洗下来，大部分还是在上面的。你可以优化一下起始咪唑的浓度。

nikonun[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Mono S下，大概15%左右，会有几个峰，每个峰都有目标蛋白，如上面的SDS-PAGE所示。

flower-201[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有一种可能是你的蛋白和载体中的蛋白相互作用了（不知道可不可能啊）
你又没有做过其他蛋白，而用相似条件结果很好的？
那你就该试试改一下裂解缓冲液了，找一下不相互作用的条件？
有些蛋白在高盐下结合，是疏水作用，或者盐浓度还不够高？

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发表于 2014-6-10 11:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有，你检测mono S的流穿峰了么，有目的蛋白么，是不是条带都差不多？
那么还有可能就是你的蛋白并没有结合上。
一般用离子交换柱分离蛋白，在蛋白结合后，先用buffer A冲洗1-2柱体积，然后再进行梯度洗脱。

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