【求助】200kD左右的蛋白Western遇见问题，请求帮忙

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标题:【求助】200kD左右的蛋白Western遇见问题，请求帮忙

changlhsyo[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的目的蛋白大概是200kD左右，样品是细胞裂解液（常规配方，4度半小时）然后 160v跑3小时左右，转移是200ma转3个小时，后面是标准步骤，一抗是买的R&D公司的抗体，应该不会有问题，二抗、ECL、显影别人都用过，应该不会有问题，就是跑不出来，希望大家帮我找找原因，谢谢。

wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不明白你说的20W是什么意思，蛋白的分子量一般用KDa的。
跑完电泳，用考马斯亮蓝染胶，看是否能见到目的带
如果没有，可能是你的细胞中该蛋白表达低，加大上样量。
转膜一般不会有太大问题。
一抗的稀释度改变一下，抗体浓度太稀可能会检测不到目的带。

changlhsyo[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

20w就是200KD左右啊，别人用相同的细胞和抗体都跑出来过的，我的细胞裂解液也跑了电泳染色是有条带的，说明裂解的问题不大。
我担心的是：电泳是160v跑了三个小时，会不会对蛋白有影响？
转移我是200mA转了3个小时，虽然mark转上去了，但是我的蛋白能不能保证转上去？
还有我的电泳用的是6％的胶，是不是还要稀一点？
谢谢

wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这个问题很可能是电转效率过低引起的。

tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-6-10 11:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的分子量这么大，不应该这么转的，最好是低电流转过夜（12个小时以上！），6％的胶够稀的了，不需要再稀了，否则还不一碰就碎了？

changlhsyo[使用道具]
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