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标题:【求助】表达蛋白纯化问题

yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-6-10 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】表达蛋白纯化问题


我用pET-32a融合表达了一蛋白（43kD左右)，在用NOVAGEN 的6His纯化试剂盒和其他的方法纯化时，目的蛋白的量不超过60%，而且无论用什么方法在30kD的地方总有其他蛋白，不知道为什么？？而且奇怪的是，用6His试剂盒纯化时，既然没有目的蛋白，到是在30kD的地方有蛋白。我都郁闷了2个多月了，什么方法都试过了，解决不了。请战友们帮帮忙分析分析啊 ！！
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guagua[使用道具]
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发表于 2014-6-10 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是目标蛋白降解了吧.培养条件是不是合适?
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耗子===[使用道具]
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发表于 2014-6-10 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第一，确定一下蛋白是否真的表达了，sds－page，根据蛋白marker确定一下
第二，如果表达，确定是否是在胞质中，如果是建议破碎细胞时加入PMSF（100×）
第三，保证盐浓度在300mM以上，防止蛋白之间相互作用
第四，建议咪唑的梯度可以改变一下，例如20mM，100mM，250mM，应该可以得到比较纯的蛋白
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-6-10 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我个人认为可能是蛋白之间在相互作用．
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8princess8[使用道具]
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发表于 2014-6-10 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得首先你应该用WESTERN BLOT 检测一下那条30K 左右的带是不是你要的蛋白或者是降解带（注意预染MARKER 和非预染MARKER 的差异），其次你可以换用不同的QIagen的NI-NTA agrose 或者Amersham 的NI sepharoes （注意它们的结合能力是不同的，在相同的条件下后者更杂些，可以采用更强的上样条件和洗杂条件）
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-6-10 15:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢上面的战友们的意见和建议。
菌体的培养和诱导表达都是参照分子克隆上的。诱导后的菌体也做过SDS-PAGE，通过与诱导前和诱导的空载体菌的比较 ，不同的诱导时间，有明显增粗的条带（但出现增粗的条带在诱导前也有，只是时间越长条带越粗，应该说是表达了），表达的蛋白以包涵体的形式存在。后面的提取和纯化全部按照NOVAGEN公司产品的说明进行的操作（因为我用的都是NOVAGENDE的试剂），总是得不到预期的蛋白。
western blotting 我也做过了，预期的位置没有条带（43kD)，出现的条带在预期位置的下面(38kD左右），我做过两次，无论是纯化还是没纯化的蛋白 ，情况一样。
还有一个问题，我超声破碎之后，收集的包涵体用6M的尿素溶解的时候，总是很不完全，总有褐色半透明的物质溶解不了，量还不少。不知道为什么？该怎么处理？？
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-6-10 15:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.预期的位置没有条带（43kD)，出现的条带在预期位置的下面(38kD左右）
我觉得你采用的 MARKER可能有点问题
2 。 ，收集的包涵体用6M的尿素溶解的时候，总是很不完全，总有褐色半透明的物质溶
我觉得你应该采用8M 的尿素或者6M 的盐酸胍去溶解，褐色的半透明的物质可能是核酸
不必管它
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