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标题:【求助】阴离子交换柱洗脱吸收峰很大但没有蛋白？

rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-6-10 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】阴离子交换柱洗脱吸收峰很大但没有蛋白？


我用阴离子交换柱洗脱，上样的样品是细菌发酵液离心后经超滤柱浓缩10倍后用90％硫酸铵沉淀透析后冻干粉溶解后上样，第一个洗脱峰很大，峰型也很好看，但电泳检测没有发现蛋白。冻干粉样品电泳检测也没有看到什么大量蛋白，但是样品活性很强。这是怎么回事呀？
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-6-10 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个我也碰到过。
我们一般用疏水柱子洗脱蛋白，经常配的蛋白含量在出峰后，一般也就200-400的紫外吸收。
但是用阳离子交换柱洗脱时候，紫外吸收达到1200左右，但是蛋白的含量并没有升高，我觉得是仪器的调校问题。
如果你说的峰形很好，但紫外吸收只有几十到一百的话，这个浓度本来就很低了。另外你说冻干了，可能冻干粉样品中有部分无机盐存在，可以加大电泳检测时候蛋白的浓度看看。
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-6-10 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能是比活很高的原因。
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发表于 2014-6-10 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用银染看看，是否为核酸物质。
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-6-10 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该是核酸和小分子色素之类的东东共同洗脱了，如果你同时开了254和214检测就会看到254或214等峰比280高。
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-6-10 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可是用考马斯亮蓝法检测蛋白浓度还很高
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发表于 2014-6-10 16:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是有脂类或多糖，不知你测得是什么活性，如果和抗肿瘤活性方面有关的话，细菌发酵所得样品很容易污染有以上杂质，其中部分是细菌内毒素，会表现出很强的细胞毒性，严重干扰活性测定，测活性时一定要做对照。脂类或多糖考染会显色，可能是和蛋白结合有关吧，具体原因不知，电泳很难分开。可以用薄层色谱法进行分离。在多波长检测时215、260nm吸收值会显著高于280.
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发表于 2014-6-10 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做SDS-PAGE时上样样品要脱盐处理的，盐浓度对条带也有影响
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发表于 2014-6-10 16:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我叫别人帮我做的FPLC图,大家帮我看看, 有峰的地方收集了样品, 用BRADFORD方法测蛋白浓度很低,但是用BCA方法测蛋白浓度很高, 做SDS-PAGE 电泳用银染,什么也看不见. 而且我的样品在有峰的地方就出现了黄色, 是不是色素引起的呢? 而且我单做色素的话,也是在同一个位置出现峰的. 老板认为是小蛋白的峰,但是我怎么也做不出来蛋白条带. 你们说这个方法分离蛋白准吗?
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