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标题:【求助】细菌全蛋白2D问题

cwcwcww[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】细菌全蛋白2D问题


昨天做了一次细菌全蛋白的2D图。样品处理方法是：超声波裂解细胞后TCA/丙酮法沉淀除杂质，再裂解液处理得上清。所得上清用于2D。IEF时水化13hr，聚焦5hr。结果图上出现了很严重的水平条纹。聚焦很差。各位高手指点指点看问题到底出在哪里，怎样改进可以改善聚焦及尽量消除横条纹。
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nn255[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的是用几厘米的胶条？怎么聚焦5hr就完成了？聚焦的条件可以参考许多有关双向电泳的手册。
　　引起水平条纹的原因很多，从样品的制备到实验的操作上都有可能存在问题。如：样品的溶解不好，存在非蛋白杂质等。你最好是先看看相关的资料后，不断的改善实验条件。
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“超声波裂解细胞后TCA/丙酮法沉淀除杂质”？
这一步是什么意思？
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summerxx[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是做细菌蛋白的。如果是全蛋白的话，只要超声后高速离心，上清放置于-80度保存，然后使用之前再离心 取上清就可以了。如果有特殊的蛋白提取要求的话，参考一下文献里写的。
水平条纹可能是你聚焦不完全，一般梯度电压升上去很慢，不可能5小时就好了。
还有你的蛋白浓度要控制一下，调节好裂解液与水化液的比例，蛋白浓度在2-3mg/ml比较合适。
我现在也在用TCA，发现TCA沉淀的时候，若TCA清洗的不完全，会有很严重的横纹的，一定要用酒精或者丙酮 清洗很多遍。然后要充分抽干，再用溶解液去溶解。
祝 顺利！
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cwcwcww[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位
我用的是１８cm的胶条
我是将菌体在裂解液中制成悬浮液，然后超声波．超声波后用丙酮法处理得到的细胞已经破碎的悬浮液．最后将得到的沉淀再用裂解液处理的，得到的上清用于２Ｄ．
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cwcwcww[使用道具]
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 小中大
楼上，你说的高速离心的速度到底要达到多少？能除去些什么杂质呢？直接用上清上样会不会存在很核酸及其他杂质，小分子物质的影响啊？胶上的点好象不多，是不是因为丙酮法造成了很多蛋白点的丢失呢？
我说的５hr只指纯粹的聚焦时间，不包括前面的水化等时间的．
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summerxx[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
离心只要15000g左右，20分钟就足够了。细菌细胞在超声破碎时，核酸等容易被超声破坏，所以影响比较小。不过你如果要求高，那沉淀还是必要的。不过我都不做沉淀。
如果跑全蛋白的话，点肯定会很多。操作步骤多了，肯定会造成一部分丢失的，所以结合你的研究目的，选择最合适的方法。建议参考相关文献！
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fox_79[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上你好，我想请问一下，如果只做细菌膜蛋白，一般采取什么提取方法，谢谢
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二丫头466[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 fox_79 于 2014-6-10 17:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼上你好，我想请问一下，如果只做细菌膜蛋白，一般采取什么提取方法，谢谢

一般而言,先得到膜蛋白和膜的复合体,可以用超声波破碎菌体,低速离心去除大的碎片,上清中应该是膜和膜蛋白的复合物以及可溶性蛋白.再将上清超速离心(建议50,000g一小时,一般而言可溶性蛋白是很难用这个速度和时间离下来的),沉淀为膜蛋白和膜的复合物.接下来的工作是膜蛋白的提取,即增溶的过程,加增溶剂后,用TCA/丙酮将蛋白沉淀下来.即可用于二维电泳.
但膜蛋白的二维电泳是一个很复杂的东东,园子里有许多这方面的贴子,你可以参考的看一下.
再提一点,细菌有G-和G+,阴性菌主要是研究外膜蛋白,阳性的膜蛋白研究相对少得多,我也是做阳性菌蛋白组方面研究的,也是刚开始.大家多交流.
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fox_79[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢您的回帖，我做的革兰氏阴性菌的膜蛋白，也是刚做这方面的东西，很多都不是很了解，希望能够共同探讨。谢谢
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