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标题:【求助】关于植物总蛋白的提取问题

JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
能不能把你提取蛋白的配方发一个啊，如果能说说步骤就更好了
我看过一些材料的提取是用丙酮+TCA来提取，根本没有用到缓冲液体系有没有加什么EDTA啊、2-ME之类的，很迷惑啊
我做的是果肉细胞的总蛋白提取，跑双向用的仪器是国产的，IEF的胶条是用空心管的那种，一切都比较落后，我看了一些资料介绍是用进口的全套装备的，不知道自己做的和配套产品的提取方式有没有什么不同的
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发表于 2014-6-10 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我参照的是一个师姐的论文，用液氮研磨后用25mM的tris－hcl（ph6.8）＋PVPP冰浴浸泡三小时，然后13000rpm冷冻离心20分钟，取上清加丙酮抽提一小时，再离心，去除丙酮后加上样缓冲液浸泡一夜来融解蛋白，上样缓冲液是完全按照分子克隆配的，然后跑SDS-PAGE，我还没跑过2－D。
可是一直跑不出条带，蛋白提的还是有问题，所以很着急。
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发表于 2014-6-10 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最后用上样缓冲液融解蛋白的时候总是有不溶物，怀疑是多醣之类的东西，不知道该怎么办。
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你先不跑2D的，我建议你这样，第一步液氮研磨后加提取液冰浴1个小时就好，然后就离心，离心后不用丙酮抽提，然后加上样缓冲液直接跑下看能不能跑出带来
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发表于 2014-6-10 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

"50mmol/LTris-HCl（PH=8）、0.2%PVP、1mM PMSF、2%巯基乙醇、50mM EDTA
操作是液氮研磨成粉，加入提取液冰浴提取30min，后离心取上清液"直接做2D应该是跑不出东西的，跑IEF的时候电流应该会很高。最好是将液氮研磨的干粉用－20°预冷的ACETONE（含10%TCA）至于－20°3-4h，然后再用冷acetone洗至上清为透明液体，取沉淀，让acetone挥发干，再按照分子克隆配制的2Dloading buffer在37度水浴溶解30min，取上清就能用于2D了。
如果有较多的糖的话，试着用硫酸氨沉淀蛋白。
用抽真空去除acetone在常温下就可以了。而且必须注意，在低温下，2Dloading buffer中的UREA会析出。
抽真空后一般不会得到粉状的东西，你看到的白色不透明的小块就是你要的了。
至于沉淀下来的蛋白的溶解问题要看是要做SDS-PAGE还是2D。SDS-PAGE直接用1D上样缓冲液，2D用2d的上样缓冲液。这些在分子克隆上都有配方的。”白色的小块“不一定会全部溶解，因为这里面可能还有杂质，但对电泳影响不是很大。
最后想问一下你做的是什么植物？
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发表于 2014-6-10 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我先试一下，谢谢哈！我做的是棉叶！
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发表于 2014-6-10 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的是龙眼的蛋白电泳
我用我说的配方提取出来以后直接跑SDS，是可以跑出比较清晰的条带来。
跑2D的时候一向IEF的电流也不大，而且我做了两个一样的一条（A）用于二向SDS，一条（B）用于IEF后直接染色：IEF后染色结果是可以看到有带的，不过明显跑得不好，而且集中在中间一段没有跑开又有拖带；用于二向SDS的就空板了；而我在二向SDS后同时也染色了放在上面的IEF的胶条B，发现里面已经没有蛋白了，按照和前面A的对比推断，应该是IEF后有蛋白在胶条内，不过二向SDS后胶条里蛋白没有了，但也没有跑进SDS胶中，不知道去哪里了，郁闷中~~
还有问个很弱的问题，经常听大家说分子克隆，请问书的全名叫什么，我们实验室不是做分子方面的，就我一个搞分子相关的，没有听说过这个书（小汗一下~~），或者ptei318战友能不能发下相关的2个loading buffer的配方，谢谢了
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发表于 2014-6-10 17:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

cuturl('http://www.cbz.com.cn/down/soft/459.htm')
这是分子克隆的下载地址，你可以去下一个
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发表于 2014-6-10 17:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果你先不跑2D的，我建议你这样，第一步液氮研磨后加提取液冰浴1个小时就好，然后就离心，离心后不用丙酮抽提，然后加上样缓冲液直接跑下看能不能跑出带来

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请问你用的上样缓冲液配方是什么，我就是一直SDS就跑不出来，你的能跑出来我就试试你的配方。Smile
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JK.jon[使用道具]
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 小中大

我听完 ptei318 说的才突然发现原来我用来跑2D的上样缓冲液不适合啊，是用来跑SDS的，应该不能用来跑IEF
复lydia5555 ：
Tris 0.7 g
SDS 2 g
甘油 10 ml（或蔗糖20g）
2-ME 5 ml
0.1%溴酚兰 5 ml
PH 6.8，dd水定容到50ml（如果你用的量不同就按比例折算）
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