小中大【求助】Western blot,遇到难题
目前我做Western blot,遇到难题,各位兄弟请指点一下,非常感谢!!
我测的蛋白是CC16（16KD）和SP-D（43KD） ，目前的情况是显色或显影都没有任何条带，转膜后，我以考染证实了有目的条带，并且PVDF膜上的条速带与胶上一样，但就在加一抗，二抗后，后显色没有信号，实验方案如下:
一、 材料与试剂
1． 样品: 先用肺灌洗液,结果不好,又做了肺组织匀浆，结果也不行。(SDS-PAGE跑肺灌洗液后,发现肺灌洗液蛋白条带较少,对应Marker附近也没目地条带，完成WB后,没有结果。然后我采用肺组织匀浆电泳后条带很多，对应Marker附近有考染浓染的条带，但最后WB后，也是什么都没有)
2.PVDF: Millipore, 0.22um
3.BIO-RAD电泳仪：Mini-PROTEEAN 3 Cell
4.BIO-RAD半干电转印仪:压： Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell
5. ECL solution :上海申能博彩，
6．DAB显色液: 博士德公司
7. 一抗（CC16和SP-D）：Us-bio公司
CC16: rabbit anti-rat CC16 pAb
SP-D: Mouse anti-rat SP-D mAb
8二抗-HRP：博士德公司
Goat anti-mouse IgG-HRP
Goat anti-rabbit IgG-HRP
9． 电泳用试剂
a) 30％的凝胶储备液：Acyl 29g+Bis 1 g溶于100ml去离子水，用滤纸过滤至棕色瓶中，4℃避光保存。
b) 1.5 mol/L Tris-buffer, pH 8.8：18.16g Tris base 溶解在80ml 去离子水中，用浓盐酸调节pH值至8.8，再加去离子水至100ml，4℃保存。
c) 1.0 mol/L Tris-HCL, pH6.8：12.12g Tris base 溶解在80ml 去离子水中，用浓盐酸调节pH值至6.8，再加去离子水至100ml，4℃保存
d) Tris-甘氨酸电泳buffer(pH8.3)：Tris base 3.03g 和18.8g甘氨酸，溶解在900ml去离子水中，然后加入SDS 1g，再加去离子水至1000ml，4℃保存。
e) 10%SDS：称10克SDS溶于100ml去离子水中，储存于室温。
f) TEMED（四甲基乙二胺）：浓度10％，20ml, 4℃保存。
g) 10％APS(过硫酸铵)：10ml,新鲜配制，分装至1.5ml离心管中，-20℃保存。
h) 4X上样缓冲液（10ml）：因为灌洗液蛋白少，所以用4X, 肺匀浆也用过2X的，电泳后条带都可以。
Tris-HCl（200mM） 2 ml 1M Tris-HCl pH6.8
甘油（10％） 1ml 甘油
SDS（10％） 1g SDS
2－Me（20％） 2ml 2－Me
溴酚兰（0.2%） 0.02g 溴酚兰
加ddH2O至10ml
分装成0.5ml/管，-20℃保存。
I)脱色液：450ml无水乙醇，100ml 冰乙酸，加ddH2O至1000ml
J)染色液：0.3g考马期亮兰R-250 , 加脱色液至100ml。
k) 裂解液：碧云天公司产品
