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标题:【求助】加了his尾巴的蛋白质为什么不能挂ni柱?

bananapeople[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】加了his尾巴的蛋白质为什么不能挂ni柱?


我已经成功在在我的目标蛋白的基因后连接了his尾巴,可是今天做亲和层析实验,发现我的蛋白全部从流过峰里面流出来了,洗脱峰中检测不到我要的蛋白?
我的蛋白是个六具体,我在c端加的尾巴, 我猜想会不会是因为蛋白折叠的原因,his尾巴都折叠到六具体的内部去了呢?
还有我用来平衡柱子的缓冲液中加了50mM的氯化钠,是不是浓度太大,也会有影响啊?
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
由于蛋白折叠的原因，his tag没有暴露在表面是有可能的。
平衡缓冲液中加50mM的NaCl其实不算高的，为了抑制非特异性吸附，通常平衡和洗脱的缓冲液中都加高浓度的NaCl,500mM都没有问题。
除了上述的可能外，你还可以检查一下，是不是Ni柱本身有什么问题导致出现这样的结果。
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bananapeople[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

会有什么原因呢! 我因该从哪些方面去检测呢?
我用的是新填料,这是第一次用的,用前平衡好了的. 我应该怎么处理呢?
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
平衡缓冲液是不是含有Imidazole呢
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有可能是标签不暴露,特别是聚合体,如果这样你只能变性条件下去做,或者由于聚合体分子量远大于别的蛋白,那用凝胶柱子也能分离.
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发表于 2014-6-10 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Histag没有暴露在表面吧，试下用8M尿素或盐酸胍变性再上柱
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bananapeople[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用尿素变性后的蛋白,即使挂柱了分离了以后能不能复性呢?
用什么方法能是蛋白恢复原来的六聚体呢?
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summerxx[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

将His标签接到N端试试
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bluelake[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

将刚表现出来的蛋白质 先用western blot (ab 用anti His )
测测看
如果有的话 表示有表现出来
如果没有的话 有可能不暴露
所以加油吧
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bluelake[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

两头都加HIS,出来的希望比较大,我曾经也是遇到这样的情况,,两头加了后就出来了,
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