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标题:【求助】大家做Western的时候有没有考虑过这个问题？

lorri[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】大家做Western的时候有没有考虑过这个问题？


蛋白在结合SDS之后均匀带上负电荷，并因此可以进行PAGE电泳以及转膜。可是如果蛋白一直这样结合着大量的SDS，对抗体的结合是不是会不一样呢？换言之，是否在转膜后的封闭、洗涤过程中，结合在蛋白上的SDS会慢慢被洗去？再换一种说法，如果蛋白被SDS饱和结合，能否被抗体亲和层析柱从一堆杂蛋白中纯化出来？
之所以想到这个问题，是因为看到前面有人提到封闭后是否需要PBST洗涤。我一般也不洗，但是标准的protocol上写明，需要多次洗涤，而且是大体积的洗涤液。而且我个人觉得，大量的SDS结合在蛋白上，必然影响抗体的结合。
如果有点想法，大家请各抒己见。
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发表于 2014-6-10 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是考虑到膜在加1抗前已经用丽春红染色及脱色以及封闭液的洗涤，其中的SDS已经被洗脱了。
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发表于 2014-6-10 17:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

LZ实在的过虑了
我们知道，蛋白一般来说，分子量不小，其上分布着N多个抗原决定簇（epitope），这些epitope会和不同的抗体产生特异性的结合，因而可以通过免疫印迹的方法加以检测
Western中，加入牛奶或BSA进行封闭的作用在于封闭那些非特异性的epitope（当然这个过程中特异性的epitope也被封闭），然后加入特异性的一抗，由于其和特异性epitope的结合能力远远超过和其他epitope，因此会竞争性的和特异epitope结合，而被封闭的epitope由于没有如此高的结合能力，仍然被封闭，因此才可以达到用免疫印迹检测特异蛋白的目的
如果依LZ的理论，在蛋白被SDS或者封闭液结合后（SDS在洗膜过程中逐步被洗脱），那么再加入一抗、二抗也不会有任何的结果，因为蛋白已经被封闭了，那么被奉为经典的western还有存在的价值吗？那么全世界实验室都在进行western的岂不都在做无用功？！
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发表于 2014-6-10 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您提到"加入牛奶或BSA进行封闭的作用在于封闭那些非特异性的epitope（当然这个过程中特异性的epitope也被封闭）"，新人没弄明白.
你的意思是牛奶会和抗原决定簇结合??听一个师兄说封闭液是和膜结合的.困惑中........
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u234[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是新手,我认为封闭液是和抗原决定簇结合的,
如果是和膜结合的话,就没有必要非要用牛奶或BSA进行封闭,因为这些封闭液与膜没有特异性结合的原理.
仅供参考……
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

BSA溶液怎么保存啊
放在几度冰箱里保存？
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您提到"加入牛奶或BSA进行封闭的作用在于封闭那些非特异性的epitope（当然这个过程中特异性的epitope也被封闭）"，新人没弄明白.
你的意思是牛奶会和抗原决定簇结合??听一个师兄说封闭液是和膜结合的.困惑中........

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膜怎么可能和蛋白结合，除非膜经过特异性的化学处理。你师兄所说的“封闭液和膜结合”，实际上指的是封闭液和膜上所结合的非特异性蛋白结合，而非仅仅和膜结合
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lorri[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先，我想纠正楼上站友一些认识上的偏差，也帮助大家消除一下理解上的误区：
1、活化过的NC或者PVDF是肯定可以和蛋白结合的，否则电泳后的蛋白怎么会吸附在膜上？如果你认为这是电泳的原因，那么，做点杂交时可没有任何电场作用，抗原蛋白照样可以吸附在活化之后的膜上。
2、用Skimmed milk或者BSA降低non-specific binding，这不叫封闭。所谓封闭（Block），封闭的是膜上没有蛋白结合或者蛋白结合未饱和的区域，消除随后的抗体直接结合在活化过的膜上的可能。这是封闭液最重要的作用。
3、抗体也用封闭液稀释，这是为了降低抗体和其他非目标抗原之间的非特异性吸附。有些蛋白带电荷的属性或者疏水的属性比较特殊，可能易于产生和其他蛋白之间的非特异性结合。用成分复杂的Skimmed milk封闭，可以让这些易于产生非特异性结合的蛋白优先和大量的Milk中的蛋白结合，从而降低抗体和这些蛋白结合的几率。BSA的封闭效果在有些特定的情况下远不如Skimmed milk，正是由于它本身成分的单一性。我们知道的，封闭液中还有Tween-20，这种去污剂的作用，正是为了封闭过强的疏水区域，也是可以减少非特异性结合。
4、蛋白结合SDS和其他蛋白与之的非特异性结合，这是两个完全不同的概念。SDS的结合能力之强，是其他非离子型去污剂可比的，更别说蛋白和蛋白之间的非特异性结合。
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lorri[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上站友在回帖中提到您师兄的观点基本上是正确的。
我在近两年做了很多Western，自我感觉对原理和技巧都还算了解得比较清楚，所以应该在理解上没有太大偏差。如果有错，还请不吝赐教。
其次，我觉得站友大约是误解了我的本意。我其实是想讨论一下，蛋白在饱和吸附SDS的情况下，如果不去除SDS，是不是就不能被相应的抗体识别。因为SDS给蛋白带来了太多的电荷，这对抗体特异性吸附是肯定不利的。本来我是在做亲和纯化的时候遇到的问题，考虑：蛋白在饱和吸附SDS时上柱，是否能结合在抗体偶联的Beads上；另外如果样品中有大量游离的SDS，是否会导致Beads上抗体的失效？我想通过Western Blotting来推理原理，因为Western中蛋白一样是被吸附了很多SDS的，但同样可以被抗体识别。所以我猜测，如果在上抗体之前SDS已经被洗去（前提是SDS能被大量的wash带走），那么用Western作参考究没有价值；而如果在上抗体时SDS还一直留存在样品蛋白上，那么抗体就能够识别被SDS大量结合的抗原蛋白。
最有可能的就是，即便我在封闭后从来不特意洗膜，但在封闭时估计多半的SDS已经游离，所以抗体结合起来还是没什么问题的。
关于后面考虑的问题，自己也不清楚，还请同行指教。
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-6-10 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

MILLIPORE 有本手册叫〈BLOTTING MANAUAL〉（？不太记得了）上面提到甲醇的作用，说甲醇一是为了稳定PAGE 胶的形状，二是剥离PAGE 上的SDS
所以在进行下面的处理前，SDS已经被除去
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