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标题:【求助】请教关于2D中平衡的问题

purrr[使用道具]
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发表于 2014-6-11 09:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教关于2D中平衡的问题


之前做2D非常郁闷，SDS后只有一张空板，5555~~特来求教
我做的2D的平衡液配方如下：
50mmol/L的tirs-Hcl，PH8.8，20%甘油，0.05%溴酚兰，2%SDS，6M尿素
平衡一次约15分钟
请问上述平衡液有没有什么问题，需要改进的
再有就是跑完IEF以后，由于一次跑的胶条有6、7条，但之后的SDS-PAGE一次最多就跑2个板，待SDS的那些胶条是先平衡了再放-20度存呢，还是跑完后直接先-20度冻存，到下次跑时再平衡呢？
还有请问各位是如何保存IEF以后待SDS的胶条的？（我是跑完IEF以后，用滤纸吸干一下表面的水然后放在剪半的粗吸管上再用锡纸包住的，这样可以分清头尾和编号）
请大家多多指教了，先行谢过~~~
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发表于 2014-6-11 09:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

怎么没有人回复啊？谁来回答一下啊，急啊
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发表于 2014-6-11 09:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

两者都行,但都要尽快去跑第二向SDS-PAGE.
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发表于 2014-6-11 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知你的平衡液是不是说的平衡母液!否则为什么没有DTT和碘乙酰胺的踪影!(或许大家的方法各有不同,呵呵)对于2D平衡是很重要的一步!最好是在IEF后冻存!在做第二向的时候再平衡,原因我认为主要是DTT的作用!DTT处理后的胶条长时间放置的话它的效用就会减退!这样你的第二向就不好看了!至于你的第二向为什么是空白,就要看你的上样中是否有蛋白的踪迹了!测一下蛋白的浓度!另外我实在不清楚你在平衡液中加溴酚兰有什么用!我是不加的,biorad和安马西亚的protocal上也没看到过这样的!也许我认识不深,还请高手指点!谢谢!
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发表于 2014-6-11 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我写的平衡液配方就是工作液了，我也知道要加DTT二硫苏糖醇和碘乙酰胺，不过我参考了其他一些的protocal，上面的平衡可以不加DTT和碘乙酰胺的于是我就不加看看了，还请高手指教这两者有什么用、不加会如何
另外，我跑了IEF以后是那其中一根进行了考染的，是看到了蛋白的，不过第2向后就白板了，莫非真和DTT和碘乙酰胺有关，望高手指教
关于在平衡液里加溴酚兰的目的是平衡时胶条会染上色，再跑SDS的时候IEF胶上面的溴酚兰会脱下来进入SDS胶，作指示剂用，也有人是加到包埋的琼脂糖里的
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发表于 2014-6-11 10:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我就是加到包埋的琼脂糖里的这个应该不是问题!主要是DTT和碘乙酰胺,DTT有助于保持蛋白的还原状态,而碘乙酰胺则可以驱除多余的DTT!不加的话出现的应该是比较多的纵条纹,至于和你的白板现象有没有关系就没有把握了!还是测测你的蛋白的浓度吧,看到底有没有蛋白在上样液里 !
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发表于 2014-6-11 10:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.胶条保存：如果你第一向跑完，不能立即做第二向。胶条最好不用处理连同胶条槽一起放进低温冰箱保存。（胶条槽要密封防止在冰箱结霜而在融化时进水造成污染）短时间（1－2天）存放的话在－20度就可以，长时间保存就放在超低温冰箱。另外冻存的胶条再进行平衡之前一定要解冻,教条上会出现一些尿素结晶体，但不影响平衡和转移至2向。
2.胶条平衡的作用：
二维电泳前一定要进行胶条的平衡，平衡步骤是将IPG胶条浸没在第二向电泳所必需的SDS缓冲体系中，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS-PAGE过程中正常迁移。平衡过程导致蛋白丢失约5%-25%，还会使分辨率降低，所以平衡时间不可过长。如果不经平衡，把等电聚焦凝胶直接放在第二向凝胶上会导致高分子量蛋白的纹理现象，并且等电聚焦凝胶会粘在SDS胶上。所以平衡时间要充分长（至少2×10min），但也不要超过（2×15min）。平衡中含有尿素和甘油是用于减缓电渗效应，否则会使以为到二维的蛋白质转移率降低，第一步加入DTT（1%）是为了使蛋白去折叠；第二步加入碘乙酰胺是为了去除多余的DTT，否则自由DTT在二维SDS-PAGE胶迁移会产生点条纹的假象，在银染过程中，DTT会导致电脱尾会显现出来。
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发表于 2014-6-11 10:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢前面两位的解释
还有一个问题就是，平衡液能不能放冰箱保存啊、大约能寸多久？是不是应该配制不加DTT和碘乙酰胺的母液呢？
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 小中大

平衡母液存放在－20度冰箱是没有问题的，可以存放几个月，DTT和碘乙酰胺在用的时候现加！（拿出冰箱融化再加，注意用的时候看看DTT和碘乙酰胺是否彻底溶解！）
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