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标题:【求助】请问： 镍柱的组成及使用方法？

kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-6-11 10:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请问： 镍柱的组成及使用方法？

我要做蛋白纯化，目的蛋白有6-His标签，需要用镍离子柱纯化，可是我没见过镍离子柱，请做过此实验的大虾们给点建议吧！Smile
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发表于 2014-6-11 10:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们用的填料是Amersham的 sepharose 4B
用的时候直接挂Ni就可以
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发表于 2014-6-11 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

带6-His标签的蛋白质,用Ni-NTA agrose介质进行金属鏊合亲和层析,杂带去除效果比较理想,蛋白降解条带比较难去除,还需通过别的途径进行分离.介质很多公司有卖,我们用的是申能博彩的价格比较便宜,刚买过3200元/50ml.比Amersham便宜多了.
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发表于 2014-6-11 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室用的是QIAGEN或者NOVAGEN公司的镍填料,很好用,也不贵.
填料是储存在20%乙醇中的,用的时候直接将填料装柱去除其中的乙醇就可以使用了,并且用一段时间效果不好了还可以进行再生,对于包含体蛋白的柱上复性效果也很好,
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发表于 2014-6-11 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有很多金属螯合的Ni柱的预装柱可以直接买到，￥不充足的话国产的就很好用。如果你有空柱子就直接买填料（很多公司有卖）自己装一根。如果想DIY就买点分子筛填料（建议sephrose）自己活化耦连Ni柱填料。
其实Ni柱的特异性不是很高，而且样品中不能有金属螯合剂，洗脱的咪唑浓度要自己摸条件多试几次。
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发表于 2014-6-11 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室用的是QIAGEN或者NOVAGEN公司的镍填料,很好用,也不贵.
填料是储存在20%乙醇中的,用的时候直接将填料装柱去除其中的乙醇就可以使用了,并且用一段时间效果不好了还可以进行再生,对于包含体蛋白的柱上复性效果也很好,
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请问你门再那里定的货,多长时间能到,我定了novagen的纯化试剂盒竟然没货,qiagen的要多少钱,多长时间能到?
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-6-11 11:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们这里有NOVAGEN公司的代理商，一般比较好买，基本上到货速度很快，还可能有现货，20ml(包括20%乙醇）填料，人民币2500元。
QIAGEN公司的慢些，具体我记不清多长时间了，大概1个月吧，我们是通过代理商买的，25ml(包括20%乙醇）填料，人民币3230元。
我们是买填料自己装柱子，自己纯化，不买纯化试剂盒。
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-6-11 11:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我要做蛋白纯化，目的蛋白有6-His标签，需要用镍离子柱纯化，可是我没见过镍离子柱，请做过此实验的大虾们给点建议吧！

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我们用的是Amersham公司的Chelating金属离子亲和层析介质，自己装柱，用的也是Amersham公司的XK26柱。使用时，将层析介质按需要的柱床体积装好柱后，先用水将保存液（20%乙醇）冲洗干净，再用0.5M NaOH除热源操作，用水冲至中性后再继续冲洗一段时间后，可以用1M硫酸镍过柱进行交联，直到全部柱床都变为绿色后，再继续2个柱床体积后，用水冲洗至流出液中不再有硫酸镍为止。然后就可用所需的缓冲体系进行平衡，备用。洗脱时可用咪唑＋平衡缓冲液进行洗脱，咪唑浓度一般选择0.5M左右即可（具体浓度需根据试验情况确定）。

[ 本帖最后由 wmp1234 于 2014-6-11 15:00 编辑 ]
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