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标题:【求助】关于膜显影的问题

koook5695[使用道具]
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发表于 2014-6-11 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于膜显影的问题


大家好 ，我这几天 做wb 每次转膜后立春红染色都可以， 一抗浓度1；200 4小时室温 10分钟洗三次 2抗1；2000 2小时 室温， 10分钟洗三次， 用北京谱理来的super ecl 发光液 1；1 总体积2毫升， 条带能出来，而且比较明显 没有杂带 ，但是，这些荧光一下子 大概30秒就基本上没了 ， 这个究竟是为什么啊？每次我都暴不出来 ，能做出来暴不出来 太郁闷了 我昨天做了一个通宵 还是这个结果 我好着急啊， 谁能给我点意见啊 谢谢；
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-6-11 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是抗体太强了,将底物消耗光了,这样的话荧光会迅速淬灭而不再有光亮,所以胶片来不及曝光,建议将二抗稀释度提高,如1:3000或更高,或者增长洗膜的时间,应该可以解决你的问题,祝顺利!
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发表于 2014-6-11 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议将一抗稀释成1：500，二抗稀释至1：3000以上
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koook5695[使用道具]
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发表于 2014-6-11 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
回楼上的 ，我曾经做到过一抗做过1；500 但是条带亮度又不够， 但是2抗浓度可能是有点高，降低2抗浓度有用吗 ？ 这方面的东西我听说的不是很高 还希望更进一步的指教 谢谢楼上 两位
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-6-11 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

降低二抗有用的。
条带不是很亮的话可以延长压片时间。
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koook5695[使用道具]
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发表于 2014-6-11 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
昨天晚上我做了个通宵， 一抗浓度依然是1；200 但是把总体积是4毫）4度过夜 2 抗浓度第一次做是1；3500 条带不错 显影时间大约有1分钟， 第2次做，转膜很好，一抗缩小为2毫升，室温2小时 （浓度不变）2抗也是室温两小时 但是没做出条带， 我很郁闷 ！！！以前一抗2小时能做出的， 只是我以前用的总体积是4毫升的 ， 我只改变了体积并没有变浓度啊 这个究竟是为什么啊》？
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-11 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉你一抗二抗孵育条件太复杂了，按标准的室温1h就好了，这个条件对于完成特异性反应足够了，再长的时间只会增加非特异性的条带。抗体稀释度最好是先参照说明书，然后再稍加调整。底物发光时间短有可能是信号太强的原因，但你说只持续30秒是不是太短了点？另一个原因就是发光底物的问题了，我现在用的是pierce的，信号至少可以持续一小时。
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koook5695[使用道具]
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发表于 2014-6-11 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我同学用我的发光盒，他的荧光强度很强，而且维持时间很长啊，他的2抗浓度用的比我还高啊。我的荧光真的只有几十秒就没了啊 连暴光都来不及啊 ，我好郁闷啊，还有所谓的室温是几多度啊 实验市开了空调温度也就是20多度吧 ，我抚育两个小时应该是差不多的吧 不会算长啊 ！！！我好烦恼
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2014-6-11 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 koook5695 于 2014-6-11 16:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我同学用我的发光盒，他的荧光强度很强，而且维持时间很长啊，他的2抗浓度用的比我还高啊。我的荧光真的只有几十秒就没了啊 连暴光都来不及啊 ，我好郁闷啊，还有所谓的室温是几多度啊 实验市开了空调温度也就是20多度吧 ，我抚 ...

从你的情况来看,应该是发光底物消耗得太快了,建议:
1.减少蛋白上样量
2.一抗1:500,4度过夜，二抗1:3500(或以上)，室温1h。
3.加显色剂后如果肉眼能看到荧光，立刻把片子压上（此时一般只要几妙钟），应该能显影。
如果几十妙后发光消失，可以再加发光液。
祝好运！
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koook5695[使用道具]
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发表于 2014-6-11 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对了 我还忘记说了 我按照没光了再加发光液做过了，第一次光比较强，然后再加就没光了，诶//////
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