蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】请前辈指教关于2-DE的问题

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】请前辈指教关于2-DE的问题

standup[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107982
精华 1
积分 231
帖子 137
信誉分 102
可用分 1481
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
1

发表于 2014-6-11 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请前辈指教关于2-DE的问题

我的实验过程基本上是按照标准过程来做的，而且实验室的另一位师姐按照这个过程也做得不错；我们两个只是用的样品有一点不同，我用的是脐动脉，她是腹主动脉。IEF电压也有5500，也去过离子。是不是我的上样量有问题或是核酸含量太大？
大家帮忙给分析一下我的胶为什么跑成这样，谢谢！


查看积分策略说明
附件
2014-6-11 16:57
88058111.snap.jpg (35.55 KB)
 
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2

发表于 2014-6-11 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的样品处理没有问题吗？你自己可以问问你那个师姐的处理过程撒 你上面又没把问题说清楚
你的样品处理是最关键的部分 只有样品处理好了 才可能在双向电泳上跑的好 我建议你还是先去找找你的样品的问题再说 很可能是你的样品的问题 还有你的IEF电压只有5500 这个好像也是低了点哦 效果 就不好拉 我具体不知道你用的是那家单位的仪器 我用的BIO-RAD 的IEF在升压和聚焦时候一般都达到10000 伏特 和聚焦电压至少也是在8000伏特电压以上 效果比较好
另外一个就是你的胶选择浓度 可以考虑改浓度低点的 或者用剃度胶
还有你要注意上样量的选择 不要太多 那样图不清楚的
顶部
is2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75851
精华 0
积分 510
帖子 680
信誉分 100
可用分 4233
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
3

发表于 2014-6-11 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

IEF的聚焦情况要以最终的VH的值而定!一般biorad的胶条17cm要达到60000-80000vh,7cm的要到20000vh,安马西亚的略有不同,不过我用相同的程序结果差别不大!我想如果你的操作没问题的话,应该是上样的问题!减少上样试试吧!尤其是样品中有高表达的蛋白的时候很容易出现你这样的问题!查查相关的资料!注意样品中的蛋白表达情况!以前看到过有人将高表达的蛋白提前去除的解决办法!(具体方法不清楚).先用低的上样量试试,染色用银染看看!祝好运!~
顶部
standup[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107982
精华 1
积分 231
帖子 137
信誉分 102
可用分 1481
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
4

发表于 2014-6-11 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢两位高人 的指导，谢谢 ！

感谢两位高人 的指导，谢谢 ！
我用的仪器是Amersham 的，胶条是13cm，上样量是210ul缓冲液＋40ul样品，电压上不去是不是有可能是上样量太大造成的？
顶部
is2011[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75851
精华 0
积分 510
帖子 680
信誉分 100
可用分 4233
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
5

发表于 2014-6-11 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电压上不去直接的原因一般是盐的浓度过高,具体造成这种情况的根本原因就看不出来了!电压不是最主要的,最终达到的VH才是标准,看它的VH的值是否能达到要求,达到的话还是能做第二向的!另外,看你的图上的蛋白的分布不是很好,很集中,可以考虑使用小PI范围的胶条这样的话应该会有些被遮盖的点出现!
顶部
gemei0115[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76303
精华 0
积分 530
帖子 658
信誉分 101
可用分 4191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态 离线
6

发表于 2014-6-11 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
几点建议：
1、你的样品pH范围比较集中，建议采用窄范围的胶条，另外你的胶条是13cm，建议换长胶条（比如24cm）通过以上两点这样蛋白点窄横向范围就分的比较清晰。即使你减少了上样量而不换胶条，蛋白点还是比较集中，对分析液有影响。
2.你的样品中由于高丰度蛋白的影响一些低丰度的蛋白的检测受到一定的限制，如果减少上样量一些痕量的蛋白可能就显现不出来，这本来就是很矛盾的问题。可以考虑除掉高丰度蛋白，一般起调控作用的蛋白，其含量都是低丰度的。
3.聚焦程序：你最后的总电压伏特小时数有些低，应该在60000以上。所采用的聚焦程序要根据不同的样品来确定。可以在聚焦程序中设置不同的聚焦梯度，我们实验室有两个聚焦程序拿来你可以参考一下：（1）40V 水化 14h200V除盐 1h、500V 线性 1h、1000V 线性 1h、8000V 除盐 30min,8000V 线性至60000Vhrs总25h，反应终止最大电压 8000V，总电压时约64464Vhrs；（2）30V 水化 12h、100V除盐30min 、200V 线性30min、500V线性30min、1000V线性30min,2000V线性 1h 、4000V线性 2h、6000V除盐2h、8000V线性 8h、共27ｈ, 反应终止最大电压 8000V，总电压时约87000Vhrs。（除盐步骤即采用 Gradient 升压模式，线性步骤采用 Step-n-hold 升压模式）
4、图中横向条纹：你的图中有很明显很粗的横向条纹，主要是高丰度的蛋白聚焦不好，（中间区域一大团蛋白，其含量很高）开始做还是要考虑上样量，如果效果还是不好，再考虑去掉部分高丰度蛋白。
5、第二向凝胶的浓度：应该根据你 蛋白样品分子量的范围调整凝胶的浓度，现在凝胶的浓度好像有些低，下部分还有一些蛋白点没有跑出来。
6、样品中核酸:样品中核酸应该没有问题，如果核酸含量高应该在上半部分有很高背景。所以先不要考虑核酸的问题。
7、竖条纹:上半部分有一定的竖条纹存在，应该是上槽电泳缓冲液不是很干净，建议上槽每次都用新鲜配制的，下槽可以用几次，但也不要用的次数太多。
8、不知道你有没有用浓缩胶，在固相2DE时完全可以不用浓缩胶，凝胶条和封琼脂糖起到了浓缩作用。
最后祝你好运！
顶部
jkobn[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75366
精华 0
积分 468
帖子 574
信誉分 101
可用分 3711
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-22
状态 离线
7

发表于 2014-6-11 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 看图像你的胶条可以不用PH= 3-10的，试一下4-7的效果会好些，因为你的点都集中到了中间部位。
2. 另外电压上不去，上样量影响不大，因为考染要1mg左右也可以上去。主要是盐离子的影响，因为血液中有相当量的盐成分，脱盐是关键；
3. 核酸的影响也很明显，加适当量核酸酶应该可以解决。
顶部