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标题:【求助】跑等电聚焦时,胶中央变形、阴极边缘有气泡...

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-6-11 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】跑等电聚焦时,胶中央变形、阴极边缘有气泡...


SadSadSad
各位高手,在下有一问题请教.我在作蛋白质等电聚焦电泳时,每次均发生胶变形,电泳的时间太短就达到了电流为0的情况.我是按照郭尧君所写的书进行实验的.电泳时使用的电压也不高(400V).请朋友们给分析一下,支个招吧. 跪谢!!!!!!
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-6-11 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我有点奇怪你的等电聚焦电压为什么这么低？
这种情况我可从来没有遇见过，不过一般出现这种情况可能有下列原因，你检查一下：
1.胶条槽底部电极是否与电泳仪上相应的电极接触是否良好？
2.胶条是否完全水化，这点很重要，要不然会导致胶条与胶条槽内部电极接触不好，导电性就差。
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 小中大
你的仪器或者胶条有没有问题啊，胶条变形可能是电流不均匀使局部过热所致．你所用电压也只有４００Ｖ，这个根本达不到聚焦的目的，所以建议你先从系统问题着手解决．祝好运．
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发表于 2014-6-11 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢两位朋友。我用400V电压是怕烧胶，因为这过程胶已经变形了。我用的仪器是北京六一的，胶条是按照郭尧君书介绍的配方自己做的。今天又做了一次，实验正在进行中。再次感谢两位！！！！
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yyaxw84[使用道具]
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 小中大

哎,胶条还是变形严重,估计这次又失败了.明天换电泳槽再试一试.
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-6-11 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位高手,在下有一问题请教.我在作蛋白质等电聚焦电泳时,每次均发生胶变形,电泳的时间太短就达到了电流为0的情况.我是按照郭尧君所写的书进行实验的.电泳时使用的电压也不高(400V).请朋友们给分析一下,支个招吧. 跪谢!!!!!!
ClownClownClownClown

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胶变形是不是冷却装置不太好 或者是电压有一些大了 跑的太快 另外你的两性电解质用量合不合适 建议多看一些针对你的装置的PROTOCAL 郭尧君的书针对等电聚焦不是很好
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yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-6-11 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用冷却装置是bio-rad的,温度是5度左右,电泳条件是60V30分钟,8mA恒流至400V,然后400V恒压至电流为1-0,这过程中在恒压400V后10分钟后,胶就发生变形,边缘有烧的现象,大约2h后电压就降为0了.洗胶后,蛋白聚焦效果很差.我用两性电解质液为军科院分装的,胶中它的终浓度为2%.今天做的效果还是不理想.心里急呀!!!!!!!!!!不知道哪位大侠有遇到过这种现象,到这边来指导指导,在下跪谢过了.
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 小中大
我用的北京六一的平板等电点电泳仪，我配制7.5％的胶，两性电解质液也是军科院分装的（PH3－9.5）。每次样品和标准都还可以。
你样品的理论等电点是好多？选择的胶的浓度、两性电解质是否与你的样品匹配？还有胶变形可能是电极缓冲浓度是否太高了？你阴极缓冲是不是1M/L NaOH？NaOH浓度太高了，引起胶变形。一般阴极是0.2M/L NaOH ，阳极是0.5M/L 磷酸
电压60V，10min；恒流8MA直到电压升为550V后改为恒压580V，知道电流为1MA。一定摇循环冷凝水。时间大约需要6、7小时。
有啥子尽管问我，这个我常常做
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yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-6-11 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

得到Ioris0186朋友的分析和帮助,在下实在是太感谢了.今天我又重复并改变了条件(主要是在配方中加入了25%的甘油)但在电泳过程中还是出现了胶变形、鼓泡的现象。
我的样品理论上的等电点是4.4左右，我选择的是7.5%的胶、两性电解质（北京军科院）的终浓度是2%，阴极缓冲液的浓度是0.5M/L的氢氧化钠液，阳极缓冲液是0.8M/L的磷酸液。电泳电压为60V，30Mim，恒流至400V，改为400V恒压至电流为0，5度恒温。在实验时我们观察到当电压升高到350V时胶就变形了。并且整个过程也不到3小时就无法再电泳了。我做过的配方有：
(1)30%的聚丙烯酰胺 3.75ml
40%的两性电解质 0.9ml
双蒸水 10.25ml
10%AP 75ul
TEMED 8ul
（总体积15ml)
(2)30%的聚丙烯酰胺 1.25ml
40%的两性电解质 0.25ml
双蒸水 2.5ml
25%甘油 1ml
10%AP 20ul
TEMED 5ul
（总体积5ml）
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yyaxw84[使用道具]
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 小中大

是8mA恒流至400V。
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