【求助】蛋白质复性

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标题:【求助】蛋白质复性

ROSE李[使用道具]
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发表于 2014-6-12 09:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我在原核系统表达的蛋白，6M尿素变性，从6M透析到4M,再从4M透析到2M，蛋白没有析出。但是用2M的尿素透析后，再用1M 的尿素透析过夜后，蛋白就大量析出。请问为什么？
如果我想在不提高蛋白质溶液体积的情况下进行复性，该采用什么方法好？
请指教，谢谢。
焦急等待中。

hold住[使用道具]
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发表于 2014-6-12 09:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

缓冲液中含有1-2M的尿素可以抑制蛋白的凝聚，应该在这一浓度上时间长一点，让蛋白肽链充分折叠，然后缓慢的去除尿素，如果不想增大体系，最好梯度透析或用尿素剃度柱子减缓尿素浓度的变化，可以加一些有利于复性的物质，如甘油之类。
或者可以试试流加法，把2M尿素的缓慢滴加到无尿素的缓冲液中，液体温度低一些，快速搅拌，要让前一滴充分稀释复性后再加下一滴，这样体系也不会太大。

glass[使用道具]
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发表于 2014-6-12 10:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

尿素梯度可以再做细一点，从2M继续按照一定梯度，分阶段透析。
一般稀释复性和透析复性必然会增大样品体积，而且蛋白浓度越低，越不容易聚集，所以不用太在意是否会增大体积，复性结束后可以纯化并浓缩。
柱上复性是个可以考虑的办法，一般变性条件下过凝胶柱或离子交换柱，然后梯度尿素流洗，可以复性一些蛋白，但容易造成蛋白沉淀堵住柱子，上样量不易太多。

kulee[使用道具]
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发表于 2014-6-12 10:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以考虑用层析柱来复性。用凝胶过滤方法可以慢慢置换缓冲体系，复性效果应该不错。另外可以考虑疏水柱上复性，通过逐步去除变性剂，蛋白正确折叠，当然不一定100％成功，但速度快而且消耗少，再者还可以浓缩加纯化。

ROSE李[使用道具]
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发表于 2014-6-12 10:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

复性过程中一般添加谷胱苷肽。请问是添在透析袋里面，还是外面？
谁能推荐一个自己实践中摸索得到的复性得很成功得复性液的组方？
谢谢了。急等中。

DDD[使用道具]
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