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标题:【求助】sds-page 问题多了，急啊~~

zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-6-12 10:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】sds-page 问题多了，急啊~~


我做了一个月的westen了，遇到一系列的问题，有一系列的疑问，请高人指点！
1.电泳速度奇快。我用六一的电泳槽，型号dycz-24D，开始配的10%分离胶，5%浓缩胶（均按照分子克隆配置),60v浓缩，25分钟到分界，80v分离，50分钟到底。
2.溴芬蓝不能压成线。我得上样量每孔只有7ul。总蛋白量约10ug。上样缓冲液是根据分子克隆配的，只是按比例缩成了5*buffer，没有dtt，就按摩尔数家的b-巯基乙醇。
3.marker条带模糊。我用的碧云天的预染marker，每次点样6ul。几本上只是一条蓝色的条。没有带。后来观察，跑到中间的时候似乎是有带的，但跑到下面以后就没什么带了。
4. 发现上电泳槽的缓冲液跑到快结束时全变浑了，好像有盐一样的东西析出来。（缓冲液是今天才配的）
我做的努力：
1.重新调整了1.0和1.5mol/l tris.hcl的ph值。在浓缩胶里似乎压缩好了一点，但是一进分离胶就散了。
2.重新配了电泳缓冲液，没有用盐酸调ph值，我量了大概ph8.03。（原来的buffer是调了的。）
3.降低电泳电压，同时加大了分离胶的浓度（12%）。我用浓缩胶40v，分离胶60v，电泳时间分别是50分钟和1.5小时。没有很大改观。marker还是分不出带的。（这个marker我是新买的，分装了，应该不会那么快降解吧）
4.考马斯亮蓝染色，我的蛋白条带好像还跑得可以，但是marker就是跑不好。
另外，甘氨酸会不会过期阿。实验室里我只找出来一瓶89年的，一瓶90年的，我就那么用了，暴汗~~
暑假里实验好痛苦啊~~我已经啃了半个月泡面了。我得猫也跟着受苦。各位高人给点指点，快点做好它，就能回家了
7月28日 我做的努力
甘氨酸我重新买了，电泳液用的我同学的，肯定没有问题。
tris.hcl我重新配了，ph值我重新校正了。
上样缓冲液也应该问题不大，因为我请同学帮我在他的胶上点样了，还好。
我现在怀疑是我得胶出了问题，我今天分别用我得30%acr/bic和同学的tris，同学30%acr/bic和我得tris配了两块胶一起电泳，溴酚蓝还是散的，跑得速度倒是慢了一点，但是还是很快。难道是sds有问题？还是我得ｔｒｉｓ和30%acr/bic都有问题？我该怎么办呢？？
　另外我想问一下，ｓｄｓ有析出是不是代表ｓｄｓ不好了？我用同学的好像就没有这个问题啊
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-6-12 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1 我用的也是六一的.前一段时间电泳时间大约5小时,后来不知道为什么缩短到2小时了.
2 我的预染marker刚开始时还不错,但是跑一会后就越发弥散. 汗啊
3 上样缓冲液最好加DTT.你加5被buffer的目的如果不是为了提高蛋白浓度的话,最好使用2被buffer
我也在实验室坚持western,食堂关门了.整天面条.
兄弟们好辛苦啊
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发表于 2014-6-12 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，看来我们的食堂比较人性话
建议上样缓冲配成2X的，临用前家DTT。
另外可以检查下配胶时用的两种TRISCL的PH。这个好像非常关键
可以观察一下电泳时的电流大小
国产的电泳仪用起来非常麻烦
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-6-12 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电流一般都是在20-30ma左右，tris.hcl ph我仔细的调了，甚至担心我得ph计有问题，还换了一个调的。应该是对的了。
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avi317[使用道具]
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发表于 2014-6-12 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
估计电极缓冲液有问题,我也有类似经历,换了新配的电极缓冲液,效果就好了.
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-12 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电极缓冲液的PH不用调。tris；甘氨酸；SDS三者按比例配好就行了，用时稀释到1×即可。
我觉得是配胶时tris-HCl的PH不对。浓缩胶用PH=6.8的；分离胶用PH=8.8的。
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发表于 2014-6-12 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的loading buffer是2*的，自配的。在配置时，我适当加了溴酚兰和甘油的量，感觉还不错。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-12 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的方子，你核对一下
2×loading buffer  终浓度  实用  5ml加
SDS  4%  固体  200mg
水  3.85ml (PH 6.8 Tris-HCl加后利于溶解SDS，SDS+ DTT增加150ul体积）
Tris-HCl, PH 6.8  120mM  1M  0.6ml
DTT  0.2M  固体  155.4mg
甘油  20%  100%原液  1ml
溴芬蓝  枪头沾取痕量溴芬蓝加入以达到电泳指示剂的效果即可。
注  500ul 分装-20℃保存>1年，融化后4℃保存>2周~2月
5×loading buffer  终浓度  实用  2ml加
Tris-HCl, PH 6.8  300mM  1M  0.6ml
SDS- - - - - - - - - - -10%  固体  200mg
水- - - - - - - - - - -0.85ml (PH 6.8 Tris-HCl加后利于溶解SDS，SDS+ DTT增加150ul体积）
DTT- - - - - - - - - - -0.5M  固体  155.4mg
甘油- - - - - - - - - 50%  100%原液   1ml
溴芬蓝- - - - - - - -枪头沾取痕量溴芬蓝加入以达到电泳指示剂的效果即可。
注  500ul 分装-20℃保存>1年，融化后4℃保存>2周~2月
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8princess8[使用道具]
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发表于 2014-6-12 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的甘氨酸使用时间太久了，建议你换一瓶试试
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fsdd817[使用道具]
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 小中大

以下是我试验中蛋白电泳各种试剂的配方，效果一直很好啊！
SDS-PAGE凝胶溶液和电泳缓冲液
1．30％丙烯酰胺储存液（100 mL )：29g 丙烯酰胺，1g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水定容至100 mL，过滤避光保存。
2．1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8（100mL）：18.2 g Tris溶于40 mL 蒸馏水中加入盐酸调pH值到8.8加蒸馏水定容至100 mL。
3．1 mol/L Tris-HCl pH6.8：12.1 g Tris 溶于 40 mL 蒸馏水中，加入盐酸至pH6.8，加蒸馏水定容至100 mL。
4．Tris－甘氨酸蛋白电泳缓冲液（5×，1L）：15.1g Tris碱，94g甘氨酸，50mL 10％SDS(w/v)，加800mL蒸馏水，待全溶后定容到1L。
5．2×SDS上样缓冲液 20mL
1 mol/L Tris·Cl(pH6.8) 2 mL
10％SDS 8 mL
甘油 4 mL
β-巯基乙醇 2 mL
溴酚蓝 0.04g
蒸馏水 4mL
6．考马斯亮蓝染色液 500mL
1.3 g 考马斯亮蓝 R-250
225mL 甲醇
225mL 蒸馏水
50 mL 冰醋酸
7．脱色液 1 L
100 mL 甲醇
100 mL 冰醋酸
800 mL 蒸馏水
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