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标题:【求助】大家看看这张片子,问题出在哪里 western blot

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发表于 2014-6-14 09:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】大家看看这张片子,问题出在哪里 western blot


这是我的一张western 的片子.我的目的蛋白的分子量在55左右,膜染色后可以看到清晰整齐的条带,一抗的浓度是1比750 是santacruz公司的产品,一抗用加有叠氮钠的5%的BSA稀释,二抗浓度为1比3000.用5%的牛奶稀释.上样量为60微克每泳道.这个抗体我做出来过,但是经常是有时做的出来有时做不出来,做出来的条带也不是很好看.
问题.为何非特异的条带比特异条带还要深
为何靠右边没有条带出现 膜染色后是有条带的


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发表于 2014-6-14 09:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

熬夜。
说说我的想法和问题吧！
1：一抗肯定是多克隆的，不然不会有杂带。
2：你的marker在那里？我看不清呀，是右边的吗？没有marker作标记，不好解释！
3：多克隆的抗体有的时候会出现这种问题，还是要重复，你以前的片子应该一起传上来进行对比。
4：如果膜上有条带，那么一定是转上了，但是显影没有，你可以充分延长曝光时间，干脆暴一个把背景都显出来的，看看结果怎么样！
继续探讨！
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发表于 2014-6-14 09:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢关心
这一张是后来再次一抗孵育,二抗孵育后的结果.我的,目的条带在55 下一点,结果在actin的地方出现了条带,连marker都暴出来了.原来那张有的部分没有暴出来我怀疑是抗体孵育得不均匀或者是显影液不均匀.这次都暴出来啦.


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发表于 2014-6-14 09:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个是我以前做的,也就是两个星期左右吧


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发表于 2014-6-14 09:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

综合比较了一下，谈谈我的观点，说的不对的地方大家多提意见！
1：总体感觉，看到这几张片子以后，我觉得你首先是试验条件还不是很成熟和稳定，例如，条带的形状，粗细，深浅和杂带的分布都变异比较大，不知道你每一次的试验条件和手法等是否有太大的出入？
2:：造成目的条带和marker 的标记不一致，有很多的原因，例如胶凝结的不均匀，胶的浓度，电泳时间等等，不知你作的什么指标，抗体的问题我想应该不存在吧，毕竟你一起的结果还行， 就是难看点儿罢了。我还挺奇怪，为什么你以前的结果比最近的好这么多？还有就是显影的问题， 我觉得从胶片上看来， 还是不错的，我的建议就是：可以的话，重新测浓度，在跑胶上下下功夫！
说的不对的地方，继续探讨！
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发表于 2014-6-14 09:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

搭车问下：
显影时间大概多少？我用的是7分钟
能不能再短点
定影时间？
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发表于 2014-6-14 09:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

显影时间，我认为没有严格的界限，要根据实际情况灵活掌握，例如有的时候，如果温度高，片子很快就会糊了，定影时间我们这里没有什么限制，不要太短，大概10分钟左右就好了，注意避光。自来水冲洗后30分钟捞出来，记得刚开始时候，忘记了，结果胶片在自来水中泡了一晚上，第二天看的时候，什么都没有了，呵呵，以后就记住了！
仅供参考，大家多交流！
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发表于 2014-6-14 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #7 am10 的帖子

显影液据说有毒？是怎么处理的？
显影时间具体是怎么控制的？
定影后泡30分钟是为什么？原来都是直接水里面唰两下就拿出来的
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发表于 2014-6-14 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是，但是没有具体研究过！一般用完后就倒掉了。
显影时间，根据所观察的目的条带的深浅变化而决定，有的书上说要严格遵守显影时间，但是我不这样认为还是灵活掌握，但是千万别糊了就行了！颜色浅或者不清楚的话，可以适当延长曝光时间和显影时间。
至于定影后用自来水冲洗还是就唰两下就拿出来，没有什么严格的规定，我们实验室一直就这样的。
继续探讨！
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发表于 2014-6-14 09:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你应该是化学发光、X光片感光吧？一抗、二抗 稀释浓度为什么这么高？
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