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标题:【求助】关于Tricine-SDS-PAGE

68943512yao[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于Tricine-SDS-PAGE


我的蛋白分子量在8KD左右，Tricine系统，浓缩胶（T=4%,C=3%)分离胶（T=16.5,C=6%),浓缩胶40V,1小时；分离胶100V，2小时；但是在浓缩胶蛋白没被压缩好，一直是很宽（应该说是很高），跑到最后结果也是一样：条带很宽，蓝糊糊的一片，而且明显有向周围弥散。是不是我的方法设计有什么问题？急！
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PINK[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
跑这么小的蛋白，应该有夹层胶的。另，你的浓缩胶和分离胶的比例似乎不对：浓缩胶和夹层胶（49.5％T，3％C），分离胶（49.5％T，6％C）。有信箱吗？发个配方给你，试剂配制比较麻烦
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68943512yao[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 PINK 于 2014-6-14 09:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
跑这么小的蛋白，应该有夹层胶的。另，你的浓缩胶和分离胶的比例似乎不对：浓缩胶和夹层胶（49.5％T，3％C），分离胶（49.5％T，6％C）。有信箱吗？发个配方给你，试剂配制比较麻烦 ...

我这个是终浓度啊。
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owanaka[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

浓缩胶（T=4%,C=3%)分离胶（T=16.5,C=6%)表达不清楚,你指的是胶浓度吧.
我跑1-5kd的,大家可以讨论一下.小分子要中间在加个夹成胶(spacer gel),还的低温跑.发个图上来看看,跟我跑的一样不,我也跑不好.
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68943512yao[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
浓缩胶（T=4%,C=3%)分离胶（T=16.5,C=6%)是指的胶终浓度,母液的浓度是
49%.我的蛋白约８kd 左右.以前师姐有跑出来,但效果也不是太好.数码相机暂不能用,所以这几天没办法发图.反正就是胶条带很粗,另外向周围弥散.条带粗好象是上样量大了,我上了40微克.夹成胶是怎么回事?
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发表于 2014-6-14 09:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

而且样品在浓缩胶中压不成一条线,到了分离胶中仍不行,整个条带在跑电泳过程中都很粗.但结果倒是在marker对应分子量的那个位置,但是条带太粗,无法确定具体分子量.
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68943512yao[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的电压30v,但是压不到一条线,还能再低吗?今天恒流跑40ma(20ma/板)了一次,仍然是这种情况:条带非常粗,根本压不倒一条线.真是急死人了!
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owanaka[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我跑０．７５mm胶两快版也用４０mＡ，压的很好的．
电压用７０v也可以压的很好，你的样品是不是加的太多了，样品加的量与扳的大小有关．
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68943512yao[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
的确是样品加多了，今天又作了一次，条带压出来了，跑出来条带看起来还不错。但在电泳过程中，条带进入浓缩胶后，在保持稳压的情况下，电流变大，由原来的30mA逐渐升为140mA,太恐怖了，不知是何原因？结果是样品没有走下来，在胶上半面部分。检查了一下，电极缓冲液、凝胶缓冲液都是新配的，没什么问题呀？好郁闷哦！
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owanaka[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在保持稳压的情况下，电流变大，由原来的30mA逐渐升为140mA,太恐怖了
稳压的情况下，电流是越来越小的．稳流，电压是越来越大的．
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