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标题:【求助】IEF聚焦时电压上不去是怎么回事？

mysmdbl[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】IEF聚焦时电压上不去是怎么回事？


请问：
我用PHARMACIA的等电聚焦仪聚焦，7cm PH3-10,聚焦程序如下：
150V 1:30
250V :30
500V :30
1000V :30
5000V :30
8000V 22000VH
但问题是，聚焦时电压一直上不去，只能达到2600左右，电流也在49uA.我在等电聚焦后2个小时后，看到电压上不去，就换了电极垫片，但几乎没有什么用。郁闷！
分析原因：文献报道说电压上不去跟样品中离子浓度太大有关，但是我的样品是动物细胞，培养了48小时后刮取的，用生理盐水洗涤后也将生理盐水吸干了，而且裂解液中也未添加TRIS盐，并且在裂解后也用丙酮进行了沉淀，应该说盐浓度不会太高，所以请各位高手指点迷津！
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

盐离子浓度会在电流上体现，IEF聚焦仪设定50uA/胶条为上限，电流过高电压当然上不去
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发表于 2014-6-14 09:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

而且，一般来说，盐离子主要是裂解过程中加入的，那大家都是用什么方法解决盐离子问题的？谢谢
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ladyhuahua[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好像没有看到楼主的胶条再水化过程，难道楼主是直接聚焦吗？
从你的实验条件看，应该不是盐的问题，做细胞的双向一般不用考虑盐离子浓度的问题，除非你的裂解液中盐离子浓度过高。
建议楼主检查一下各项参数设置是否正确，另外还有样品的溶解性的问题。
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发表于 2014-6-14 09:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的水化是采用的被动水化12h,然后再转移到聚焦槽中的。
多谢楼主从其他方面给我提了个醒，设置参数应该没有问题，而关于样品溶解性的问题，我在将丙酮沉淀的样品复溶后也用12000转离心了30min，再进行定量，然后再水化的，应该也没有样品溶解性的问题，请高手赐教！
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发表于 2014-6-14 09:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

7CM胶条无须设置8000V的聚焦电压, 实际上, 7CM胶条在4000V聚焦就够了.
如果生压有困难,可以就2600V聚焦,但延长聚焦时间,保证足够的VH.
你的问题似乎不全是盐离子的问题. 你可以改变你的聚焦条件, 去掉8000V 步骤,延长5000V (或4000V)的升压时间试试.
另提醒，水化过程应该加了矿物油吧？有一个朋友因为升压困难问我原因，一个个原因排除后才知道是水化时没加矿物油。呵呵，希望你不是这个原因。
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发表于 2014-6-14 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

至于设置,我们的7CM 胶条是这样的:
250V 40分钟 线性
500V 40分钟 快速
4000V 3小时 线性
4000V 20,000伏小时 快速
500V 24小时 维持
50uA/胶条
一般我们总电压上到15,000-16,000就可以了.不过仪器不一样,仅供参考.还有,第一步和第二步的是除盐,如果你的样品含盐比较多,可以延长些时间.如果你在优化条件后,仍考虑是样品含盐导致的,可以使用可除盐的试剂盒.
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发表于 2014-6-14 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，我还有一个疑问是这样，我用 BIO-RAD 的PROTEAN 2等电聚焦仪电压很快能上到4000V，而且电流也能降到9uA左右，但是我用PHARMACAI 的IPG phor电压就是上不去，一直在2500－3000V左右，电流也在50uA,而且我现在只能用PHARMACIA的仪器，所以现在很郁闷!
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mysmdbl[使用道具]
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发表于 2014-6-14 09:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 7437654 于 2014-6-14 09:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

7CM胶条无须设置8000V的聚焦电压, 实际上, 7CM胶条在4000V聚焦就够了.
如果生压有困难,可以就2600V聚焦,但延长聚焦时间,保证足够的VH.
你的问题似乎不全是盐离子的问题. 你可以改变你的聚焦条件, 去掉8000V 步骤,延 ...

多谢你的建议，关于矿物油的问题，我每次都加了的，这不是问题.
7CM 胶条用2600V聚焦够吗？这三次我的电压也都能到2200－3000V左右，聚焦时间也到了22000VH，但是最后染色还是不行，很明显的由于聚焦不充分而导致水平条纹。期待中。。。。。
还有你说的“你的问题似乎不全是盐离子的问题. 你可以改变你的聚焦条件, 去掉8000V 步骤,延长5000V (或4000V)的升压时间试试”，你觉得只是将聚焦条件改变一下有效果吗？我实在心里没底，不知道你是否遇到过相似的问题，谢谢！
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发表于 2014-6-14 09:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我初学2DE技术时使用7cm的IPG胶条，也出现电压升不上甚至断掉的现象，而且电流也不大，后来换了仪器就好了。我想有几点建议：1你每次聚焦时同时跑几根胶条呢，如果各胶条样本差异比较大，那电流分配不均匀，当然升压困难了。2 在聚焦开始的除盐阶段，你可以延长时间试试，或者升压时间也延长，会有帮助的。3 换用长的IPG胶条，如果顺利说明你的操作仪器等每问题。4 还是检查一下仪器好了，以防系统差错。祝好运。
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