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标题:【求助】western blot遇到的问题？

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发表于 2014-6-14 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot遇到的问题？


我最近又在跑western blot，之前我跑了一年， 可这次却不知道怎么搞得， 进入分离胶后溴芬蓝就弥散， 如果用15%的胶跑，欲染marker中的红色带（72kba)，以后就不能进入分离胶了， 而且进入分离胶的带也弥散。我们重新配了各种缓冲液，又换了另一台电泳仪，还是解决不了？ 回想和去跑得一样的条件，快一个月了，请各位指点，多谢！！！
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发表于 2014-6-14 15:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

希望大家能尽快给我方法，我看了 里面的很多贴子，但没有好的解决办法。 我去年一直跑得很好， 今年突然出现了这种情况。
在积层胶里跑的还可以，一到分离胶就样品弥散，很宽的条带，而marker 红带以后就不能进入分离胶（15%），我试了10% 分离胶可以进入，但弥散很宽的带， 重配了三次缓冲液，而且前天换了一个新的电泳仪 ，我用的是Bio-Rad公司的。
急需帮助阿！！！
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发表于 2014-6-14 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

都一样没 ，什么都没有变，就是10%的分离胶，但跑出来都非常弥漫，条带特别的宽， 急啊
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发表于 2014-6-14 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

弥散的条带非常宽，可能是你上样量的总体积比较大。你试一试增加蛋白的浓度，减少总的上样蛋白的体积。
还有就是看看你的loading buffer是否有SDS的沉淀，如果用的时候没有好好溶解loading buffer沉淀比较多的话，电泳的结果也会比较弥散
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发表于 2014-6-14 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用LoadingBuffer +DTT后煮沸，然后我每次都12000rpm 离心5分钟，所以不应该是Loading buffer的问题，以前我一直都用。 上样的量不大，
今天我又把以前配的30%PAA 用滤纸过滤了一下，又跑了一次， 15% 的胶，结果仍是Marker 红条带72kda以后的跑不开，而且跑进分离胶的那几条Marker条带，到最后都快看不清了 ，原来重来没有这种想象。marker都可以跑进分离胶去， 请大家帮个忙阿 ，
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发表于 2014-6-14 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

电压我也改变了，从80，100，120，150，200，都试过了，就是不行。
10% 的胶倒是可以把marker跑进取，但非常宽的条带
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发表于 2014-6-14 15:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

出不来，出来就无所谓好坏了，我可能蛋白也下不来，好像是修芬兰和蛋白分开了，修芬兰早就跑得很远了
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发表于 2014-6-14 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
配胶的所有溶液都重新配一遍可能可以解决问题
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发表于 2014-6-14 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我不敢确定，但从我个人看来问题应该还是出在聚丙烯酰胺凝胶上，跟别人借点试试，光过滤我看不能完全解决胶内部聚合问题。
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发表于 2014-6-14 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

但分离胶跑得很好啊 ，这就不能说是聚丙烯酰胺凝胶的问题，真烦人
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