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标题:【求助】请教SDS-PAGE

qhyu[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请教SDS-PAGE


我在做蛋白电泳时，整个蛋白胶的条带都不是很清除，比较淡，是什么原因 呢。菌体裂解的不好、上样缓冲液有问题、染色和脱色出问题，这些原因中哪些最有可能？要是110KD的蛋白，根据分子克隆上的参考的话，得选择6％的分离胶，我选用的是10％的，因为我发现大部分条带都跑到下面去了，上面很大区域是空白，10％的胶能跑开吗？
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白量要保证,还有染色和脱色应该注意一下.10% 的应该可以.
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

会不会是蛋白样品的离子强度太大？如果是这方面的原因，可以透析或超滤除盐
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果以前很清晰的话，可能是染色液的问题。我跑70KD的蛋白也用10%，有一时间条带很不清晰，重配了染色液后条带重新清晰了，包括以前不清晰的样品。
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qhyu[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的染色脱色液都是重新配过的，可是也不是很清晰，我现在打算重新来过，包括上样缓冲液都重新配置一次，看看会怎么样，要是还不行的话，我就真的没辙了～！
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发表于 2014-6-14 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得可能是样品的问题，没同时跑一个标准蛋白？你的样品可能有核酸在里边干扰。
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是有可能SDS的浓度过高了呢?
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
10%的胶应该能跑开的。关键看带型是否弥散，要是带型正常，只是颜色偏淡，建议重配loading buffer和脱色液，要是带型不正常，要从配胶方面找原因了
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qhyu[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢大家的建议和意见，我在问一下，在脱色的时候，按照分子克隆第三版的方法操作的话，有什么利弊呢，如果染色液按照分子克隆上说的配制，那脱色液用甲醇：水：冰醋酸为5：4：1的配方怎么样？
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qhyu[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有就是甲醇的比例与脱色效果有没有什么必然的联系呢，比如说在一定限度内，甲醇浓度越高脱色效果越好什么的？我不知道甲醇对脱色有什么作用，希望指点一点？～！
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