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标题:【求助】怎样能使条带清晰？

niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】怎样能使条带清晰？

我做的wb,上样量 80ug;一抗1：400，4度过夜； 二抗 1：500，1h；碱磷酶显色，背景深，条带不够清晰，请高手指点。不胜感激！！


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2014-6-14 15:51
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是否能够通过调整抗体比例能够解决问题，还是其他环节需要改进？期待您的帮助。谢谢！
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发表于 2014-6-14 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1，封闭O/N,4C；
2，最好选用单抗，一抗按说明书最好做低中高梯度；
3，转膜最好用湿转，冰浴。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

条带清晰主要取决于电泳凝胶上的条带是否清晰.
背景深还有可能是显时间较长或洗涤不够充分.
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上二位的帮助。
转膜后用丽春红预染，条带还比较清晰，一抗说明书是1：100~1：1000，起始浓度1：200，我也试过1：800，1：1000，结果不理想。
显色时间是比较长，因为条带总不是很清楚，所以延长了显色 时间。洗涤是TBST 5min， 四次； TBS 5min 二次。
实验不知道怎样往下作了，郁闷啊！还有哪些高见？
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xue258[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
洗一抗，二抗时振荡速度好像也不要太快，快了会贴在壁上，不容易洗干净。还有一抗的浓度是不是需要调整一下啊。显色时间缩短看一下。我们做的时候也是显色时间比较长，结果因为二抗没洗干净，背景染色深，条带很模糊。我也不知道自己说的是不是，因为我也才开始做。做个参考吧
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道一抗浓度该怎样调整，我也作了1：500，1：800，1：1000，可是结果也不理想，条带很淡，还不如1：400。我今天在做一次1：400，把二抗浓度改为1：1000，缩短显色时间试试，但愿能有好结果。
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这次的结果还不如上一次，简直就要崩溃了。我做的是膜蛋白，是不是样品有问题？我用的是碧云天的P0013 Western及IP细胞裂解液 提的蛋白，它的说明书上没有明确说明是否可以用来提取膜蛋白，有知道的朋友快帮帮我。谢谢先！
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-6-14 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同意楼上的意见，试试压片的方法，我也遇到过这样的问题
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