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标题:【求助】蛋白纯化遇到的问题

jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白纯化遇到的问题


我用Ni柱纯化一个大约28kd的蛋白，过完柱子跑电泳发现第一次（20M的咪唑）就把目的蛋白洗下来了，目的蛋白没有挂到柱子上，不知道是什么原因，恳请那位高手给予指点，谢谢！
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guagua[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你给的信息太简单，请将你的流动相条件，样品，色谱柱规格，流速等色谱条件给出。
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是一个His-tag纯化试剂盒，我的蛋白是用原核表达载体PET-24d在BL21中表达的蛋白，大约800bp，是表达菌株25度诱导表达6h，收集菌体，加入Bind Buffer后超生波破碎后 离心得到的上清液，过完柱子后，发现蛋白没有挂到柱子上，能给分析一下原因么？
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

binding buffer具体采用的是什么呀？
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

NaCl ,磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，10mmol的咪唑
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发表于 2014-6-14 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的蛋白用镍柱纯化合不合适？有文献报道过吗？是带有His-tag的吗？并不是所有的蛋白都可以用某种方法纯化的
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发表于 2014-6-14 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
介质是不是不行了
你的柱子是否有充分再生
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果His标签没有完全暴露的话是有可能发生这种问题的，你可以在超声破随后的上清夜中加入一定量的尿素，至终浓度为6～8mol/L，这样可以使his标签充分暴露，有利于蛋白结合。
另外，可以尝试一下Cu2+柱
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发表于 2014-6-14 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

换配基密度更大或者手臂更长的填料,此外提高上柱的pH,降低流速,这样应该可以改善,也可以在20mM以下做阶段洗脱,能分开就可以,因为我见过1,2,,3,4,5,6mM阶段洗脱的,优化一下吧.
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Liuzihaogfbdvs[使用道具]
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发表于 2023-4-9 13:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】His标签纯化蛋白不挂柱

我用pET-28a载体表达了一个蛋白，WB一抗用His-tig单抗能检出目的条带，而且是部分可溶性蛋白，但是用Ni柱纯化却几乎没纯化出蛋白。
纯化步骤：先后用超纯水和Binding buffer冲洗柱子，再将破碎上清和填料混合，在4℃振荡结合过夜，第二天把破碎上清和填料混合物装回柱子，收集流穿液。先用Binding buffer冲洗，再用Elution buffer 1mL洗脱蛋白,分别洗10次。（Binding buffer:20mM Tris-HCl,10mM咪唑，0.5M NaCl;Elution buffer:20mM Tris-HCl，500mM咪唑，0.5mM NaCl)
用SDS-page检测，发现纯化出来的蛋白条带很细，有很多杂带，并且流穿样的目的条带和上柱前的破碎上清目的条带没什么差别。
烦请各位大佬帮忙看看是怎么回事，该怎么样改进，谢谢！
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