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标题:【求助】脑组织超声破碎具体该怎么做啊？

txwuyan[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】脑组织超声破碎具体该怎么做啊？

我将大鼠海马组织使用组织列解液匀浆后使用SONY超声破碎仪30秒，发现匀浆液变黑。是不是碳化了？具体规范的操作步骤该是什么？什么样的称为破碎成功？谢谢，急
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u234[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

取海马，加裂解液，直接超声破碎即可，我们一般设置2秒/次， 每次间隔10秒，频率300W。超声2次，至多4次即可。样品放在EP管里，外面用碎冰包住，防止过热。海马质地软，并应太费劲吧。发黑的情况我们没见过。像我们那样处理，我们做过western, 蛋白质组学，没问题。
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txwuyan[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
难道不需要匀浆吗？你们蛋白样品中跑胶后用考马斯亮蓝染色后发现大于80KD的条带基本没有，小于80KD很清楚，是不是我的大分子蛋白降解了，我的蛋白浓度2－3毫克/毫升，但是做WB老是做不出来。现在我 怀疑我的蛋白样品提取有问题。非常谢谢你的 回答。
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u234[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们不匀浆，直接超声。匀浆后还需将匀浆液转移出来，蛋白会损失，也麻烦。80KD蛋白我们做出来了，你在试试。
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u234[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

推荐你先用beta-actin作实验，此蛋白各组织均有，将它做出来了，就说明你各步条件正常，试液配制没问题，一抗、二抗良好；然后你再用你的目标蛋白抗体作 。
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txwuyan[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

beta-actin做出来了，X光片显影条带很浓和很大。但是目的蛋白总是做不出来。会不会超声破碎将大分子蛋白打断了。
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nvdabing[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你超声时探头是不是碰到EP管壁了，那样的话匀浆液也会变黑的
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txwuyan[使用道具]
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发表于 2014-6-14 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是的。那样对蛋白样品影响不大吧？我感觉样品的温度也不太高啊
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