【求助】WB出现条带超多，不知该如何解决

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标题:【求助】WB出现条带超多，不知该如何解决

nikun230[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 一抗是HRP标记，目标蛋白是65KD,做了三个稀释梯度1:2500,1:5000,1:10000.
2. 蛋白样品是TCA（人舌癌细胞）细胞，制备过程为：加2ml细胞裂解液（北京普利来公司产品）到一瓶（250ml）长满TCA细胞细胞瓶，滴管反复吹打，置4°裂解细胞5分钟，转移到1.5ml EP管，按比例假如loadding buffer，沸水中煮沸5min，离心取上清上样！
3. 浓缩胶80V,跑30min。10%的分离胶用100v跑1.5小时左右。转膜为湿转，300ma转1个小时，立春红S染膜能看到清晰蛋白带。
4.3% BSA 在4°封闭过夜，TBST漂洗3次，10min/次，上一抗（如1所述）室温（25°左右）低速摇床孵育2小时，TBST漂洗6次，10min/次曝光,显影，定影得到如下图结果。做了几次结果都相似，急死我了，请各位前辈多多指导呀！

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2014-6-14 17:08

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glass[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

就是非特异性显色的问题
1、首先考虑减少二抗浓度，上文中我怎么没看见你使用二抗？
2、减少曝光时间和显影时间
3、加强封闭（增加BSA浓度或改用牛奶，我看你已经过夜了，时间应该没必要延长了）
4、增强TBST洗脱增加洗脱次数和洗脱时间不过你已经6次了。。。
并不是大问题，继续摸索一下就好了别急Big SmileBig SmileBig Smile

dog002[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Do you have to wash 3x10' after blocking?

婴儿脸[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是不是一抗有问题啊？？特异性不够，因此跟别的非特异性抗原结合产生多种条带？？有一次我做得也是出现很多这种梯装带，后来考虑还是没洗干净，你的TTBS加TWEEN20没有啊？？还要注意一下TTBS 的PH值！！我第一次做没调PH值后来再洗脱这步注意了调TTBS 的PH值，并且每次摇洗15分钟，洗3次，就再没出现这种情况！

glass[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先不应该考虑一抗的事情，只有真的是无法调整了，才最后怀疑一抗

33号[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

降低二抗的浓度，先别管抗体建议的稀释浓度

flower-201[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

The problem often lies within the specificity of the primary antibody, provided the blocking is sufficient. If you block with 10% NFDM and still get strong background, I would think the primary antibody is not good.

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1、首先考虑减少二抗浓度，上文中我怎么没看见你使用二抗？

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前文HRP直接标记在一抗上面，所以没有使用二抗系统。
同意楼上战友观点，前文使用多抗，非特异条带难以消除，首推稀释抗体降低背景，也需压片技巧。
前图中一抗1：10,000而且没有使用二抗系统，信号如此强大，甚至出现了几处反影（白色的小片中空影）请问是使用pg级的底物吗？我们ng级的底物一般没有这个本领把少许游离的底物也显示出来。如果是这样的话，10倍稀释抗体吧，如果还不能解决，可以在红灯下通过压片技巧解决。具体解释见文：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/5936631') 的注7即是。因为仅使用一抗系统（仅有1个变量，而没有二抗系统增加实验的复杂性），理论上可以通过降低抗体浓度解决背景高的问题。如果前文使用ng级底物，那么也可以通过稀释抗体解决背景。

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发表于 2014-6-14 17:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近也被这个问题烦着，哪位前辈能指点一下么？
转膜没有问题，但是只要gel上面有的蛋白带都有和抗体结合！我用的是anti-his HRP conjugates,只用一抗就可以了。我用的一抗浓度是1：4,000。

mogu[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

把封闭液换成脱脂奶粉，BSA封闭效果并不是很好。我以前也有过类似的经历，用BSA封闭的膜曝光后黑乎乎的一片，换成5%脱脂奶粉就一切都正常了。此外，一抗直接标HRP并不推荐使用，因为如果一抗本身特异性不好就会造成高的背景值。如果可能还是建议用普通的一抗加上标记有HRP的二抗来完成试验比较好。

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