【求助】如何在Ecoli中表达真核生物基因

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标题:【求助】如何在Ecoli中表达真核生物基因

xevin[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的载体是pET-28a(+)，菌株是BL21(DE3)。靶基因来自植物，该基因相对于大肠杆菌来说，其稀有密码率为7％，且在5'端很接近ATG的位置即有出现。表达蛋白的理论大小为20kd。我表达了几次也没有表达出目标蛋白。我是这样做这个试验的：
1、融合蛋白质粒通过Call2转化法转入BL21；
2、将阳性菌液接种37度培养过夜；
3、第二天，按1：100将过夜培养菌加入10ml新鲜抗性培养基中，37度扩大培养2个小时；取出对照；
4、向剩下的菌液中加入IPTG至终浓度1mM，28度继续培养4h，8h，收获菌液；
5、用2X的sample buffer破裂细菌，煮沸，离心，取上清跑SDS page胶。
结果没发现靶蛋白的条带！真不知是何原因。
该实验为paper所必须，恳请各位帮忙，在这里先谢谢大家了！

了了[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:20 资料个人空间短消息加为好友

小中大

为什么诱导后用28度，会不会是温度太低了。

huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

换一下宿主菌，用Rosetta－gami（DE3），该宿主菌能提供稀有密码子。同时诱导时要做阳性对照，保证诱导系统没有问题。

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最需要的是将宿主菌换成Rosetta－gami（DE3），解决稀有密码子的问题。然后试一下诱导温度，做个温度梯度看看。

BUK[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不行就换个载体吧, 感觉用带GST tag de vector 容易表达的.

xevin[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

看过很多帖子，一般认为温度对表达的影响较大。我今天再表达试一下，如不行，就只好换个载体了。但不知Rosetta－gami（DE3）是那个公司的，常用否？

xevin[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

为什么诱导后用28度，会不会是温度太低了

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有人说30度，37度均可，但也有人认为在25度表达较好。你用过这个表达系统吗？

yychen[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1）整个实验流程没任何问题
2）改变诱导温度和时间于问题不会有质的改变，通常如果蛋白表达量过高形成包涵体后放在低温下培养，蛋白易于正常折叠而成可溶形式；若想蛋白表达从无到有，改变培养温度和时间，或者诱导剂的含量等几乎是"mission impossible"
3）蛋白表达不出的根本在于基因本身的问题，如你提到的稀有密码子偏多等原因；另外主要是转录的问题，如该原核启动子对目的基因不起作用等，因此改变的方法只能是换表达载体以及宿主菌
4）我最近表达了一个细菌蛋白，当时克隆的时候装了两个表达载体，结果其中一个表达量达到了总蛋白的50％以上，另一个则压根没表达，连western-blot都没信号，这种问题一般很难用原理来解释的，有时候只能碰运气了

xevin[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢大家,看来我只好换换表达系统了。有哪位用何表达系统成功的表达过真核基因吗？能否推荐一下？