【求助】关于western blots 转膜问题

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标题:【求助】关于western blots 转膜问题

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发表于 2014-6-14 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做过western blots的战友,应该都知道转膜是其中的关键步骤之一,转膜是否成功很大程度上决定了最后是否能够出现条带.
在这里我介绍一下自己的经验Smile,希望对大家有所帮助,希望大家遇到同样问题能够迎刃而解.
1.转膜电流:
a.膜面积×1.56(常数)--------此为所谓的"快转",一般适用于KD数比较大的蛋白;
b.膜面积×0.65(常数)--------此为所谓的"慢转",一般适用于KD数比较小的蛋白.
常数皆为经验值.
2.转膜时间: 与KD数相等,或稍微大于kD数.
这是我们实验总结出来的规律,如果大家觉得可行,不妨按照此方法做一下.
希望大家各抒己见,畅所欲言,发表自己的转膜经验Smile谢谢

mimili_901[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

半干转还是湿转啊？
时间应该是分钟吧？！

greenbee[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

半干转的时间用的了那么久么，我做的100多KD的蛋白基本上50分钟就可以了在多了基本就过了，用预染MARKER比较直观，而电流我们一般就和面积（平房厘米）一样大（mA=S×1），电压一般是浓缩胶65V分离较110V其实这个影响不大，看来是个人自有个人的方法啊，呵呵，大家多交流相互改进吧

mod=8048[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们电压一般是浓缩胶80V,分离胶120V,跑浓缩胶时间基本上需要30min,而跑分离胶大约需要2个半小时Smile

mod=8048[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

这几次转膜出现了以下问题,想请大家给点意见:
1.相同条件下跑了两板胶,一板染考马思亮兰,蛋白条带清晰锐利,转膜时所有的加样条带只在最低下出现了一条细带(包括加marker的那个孔),转膜后的凝胶染了一下考马思亮兰,上面并没有蛋白条带.
2.我们用的是湿转,恒流,第二次加大了电流,0.3A,2h,结果相同.转后的凝胶染色不均匀,但并没有蛋白条带.
3.然出来的唯一一条带的大小大概是溴芬兰大小位置,但溴芬兰在转膜过程中不是并不结合在膜上吗?

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

转膜后的凝胶如果蛋白已经转到膜上，那么考马斯亮兰染色是不会有条带的呀！

ffaa[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该有条带，但是最好不要用考染，最好用丽春红燃料进行染色。