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标题:【求助】蛋白电泳条带还是很模糊

bhka[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白电泳条带还是很模糊


我在跑SDS-PAGE电泳时，不知道为什么40kd左右以下的蛋白条带比较模糊，40kd以上的蛋白条带都比较清晰，这个问题都困扰我一个月了，我也尝试了不少的解决办法：重新配置试剂，采用15%的分离胶，上样前完全变性蛋白，（我是用SDS裂解的细菌沉淀，但没有加β巯基乙醇），电泳条件也尝试了不同的电压，希望各位高手指点一下. 我也精确的调了ＰＨ值，但是就是效果不好，（我用的是ＭＩＮＩ胶，８ＣＭ高的）
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发表于 2014-6-14 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能你的APS， TEMED加的太多了，最佳的聚合时间是8-10分钟，
过量的催化剂会改变溶液的pH,聚合的胶会很脆，这样跑得时候容易模糊或者位置偏移。
不知道能不能帮到你
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发表于 2014-6-14 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵　谢谢，我的现在我配１０毫升分离胶１２％加４微升TEMED基层加３微升，ＡＰＳ也不多啊１０％的１０毫升分离加１００毫升，３毫升基层加３０毫升
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你用的是什么缓冲体系,建议用TRIS-HCL缓冲溶液,出现这种现象的情况我分析大致有以下两种情况,一是因为胶中杂质比较多导致前沿滞后,处理方法是胶溶液过0.45膜或者预电泳半小时;二是你的胶在40000以后的位置浸泡在缓冲液,而你的胶板两侧漏电导致条带开始出现散乱,处理方法是夹紧胶版.
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04906[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也有这个问题，30kb以上条带很好，30kb一下的就是smear
我觉得不是AP和TEMED的问题，有可能是胶里的杂质，但是为什么30kd以上的条带却很好呢？
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BOSS2011[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般胶在15分钟以上1个小时左右聚合都是正常的,胶聚合的时间太短会导致胶聚合不完全.时间太长的话胶会开始变硬,也不好.AP是要按照比例加的,这个不能少加也不好多加,TEMED因为是催化剂可以根据凝胶时间情况加量,楼上所说的情况多半是胶中杂质所生,造成这种情况是因为带电杂质也会电泳,有些杂质跑得比较慢,所以在你电泳结束之前很多杂质还在胶的中间,就像是电泳前沿一样,很有可能下面的条带染不上色或很散淡.
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发表于 2014-6-14 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的就是TRIS-HCL缓冲溶液
不好意思，请问胶溶液预电泳半小时是什么意思？就是把电泳装置完全装好，把凝胶也加上去，就不加样品，跑半个小时电泳吗？
胶里面的杂质怎么样去除啊
我用的液体都是新配的，是不是丙烯酰胺溶液需要过滤吗？如果过滤用一般的滤纸可以吗？
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发表于 2014-6-14 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我还有一个问题，如果预电泳的话，那么内外槽的电泳缓冲液ＰＨ值不就改变了吗？然后再加样品结果会不会受影响？
不好意思，我做蛋白的时间不长，有的问题比较．．，希望谅解
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发表于 2014-6-14 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

所谓预电泳，只适合于连续系统，对于我们跑SDS－PAGE常用的Laemli系统（不连续）来说，预电泳是不合适的。所以不要预电泳。
上边条带清楚，下边不清楚是电泳的普遍现象。但如果在15%胶上40K以下就不清楚了则不正常了。我想到了几个问题，不一定正确，仅供参考（其中1、2两点楼上已有人提过，重提一下）。
1. 浓缩胶的pH是否准确；
2. 聚合时间。聚合时间有两个问题，一是你自己的控制，一般在二三十分钟（可以观察到胶面的时间）；二是你做完分离胶到做浓缩胶以及做完浓缩胶到上样，中间要有足够的时间间隔使其聚合充分；
3. 离子强度。样品中的离子强度不宜过高。
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bhka[使用道具]
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发表于 2014-6-14 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家的建议很好啊，我回去都试试看．
　　如果我换电泳槽用六一的ＤＹＣＺ－２２Ａ型单垂直电泳槽，它的凝胶板是１７０*１８０mm 我一直跑的是迷你胶，没有跑过这样的大胶，请问大家这样的胶用什么样的电压跑，然后铺胶的时候，基层胶很分离胶各铺多高，还是梳子下一厘米铺分离胶吗？　
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