【求助】关于WB转膜问题

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标题:【求助】关于WB转膜问题

uaubc[使用道具]
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发表于 2014-6-17 10:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人用原核表达系统表达了一可溶性蛋白,分子量为16KD.想通过WB检测该蛋白的活性,可转膜2次,均没有成功,该蛋白仍旧存在于凝胶上(考染可见到凝胶上有很浓的带),而预染MARKER转膜成功.该蛋白经ELISA检测具有很强的信号,想请教一下出现此问题的原因及解决办法,本人网上等待.谢

yonger[使用道具]
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发表于 2014-6-17 10:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你看过膜上确实没有蛋白条带吗？可能你的蛋白量太大，转过去一部分，还有一部分仍在胶上。

lxh031[使用道具]
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发表于 2014-6-17 10:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PVDF膜需要甲醇处理后进行转膜,否则会影响转膜效果.具体可以查看一下millipore 的user mannual.GOOD LUCK!

7437654[使用道具]
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发表于 2014-6-17 10:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1 ，你的蛋白表达量很大，你可以调整上样量，
2，你用的NC膜吧，转膜条件如何，NC如果电流过大很容易将蛋白透过，但是由于你的蛋白表达量很大没有完全转完还剩很多在胶上所以你没有注意，可以同时跑两块胶一个转膜，一块考染比较
3 ，你的分子量太小，建议你用0.22um孔径的PVDF膜（小于20kd的蛋白），常用的膜都是0.45的，NC膜好像也有0.22的但是没用过，PVDF膜在转膜时蛋白不能透过

uaubc[使用道具]
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发表于 2014-6-17 10:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位的建议,我用的是NC膜,至于膜孔径大小,我倒还没有注意,我也只好试着用一下,0.22UM的膜了.

ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-6-17 10:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的转膜体系是什么样的啊?
我们50kd左右15v1个小时
你最好换0.22UM的膜,然后根据你的具体情况调整你的条件!!!!
good luck !!!!!

qqq111[使用道具]
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