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标题:【求助】western显影，发光试剂倒膜上见弥漫荧光

moonlight45[使用道具]
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发表于 2014-6-17 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western显影，发光试剂倒膜上见弥漫荧光


western新手，操作2月。
发光试剂盒采用百泰克的 ，刚开始做的时候，将发光试剂（B液即避光保存的那个，要用双氧水提前活化）倒在膜上肉眼未见荧光，显影是弥漫未见条带。
1星期前，二抗之后又杂三抗，TBS摇床洗10分钟×3次，将发光试剂倒于膜上，压片时可见膜上弥漫荧光，压片2分钟，显影5秒暗室红光下见胶片变黑。日光灯下可见高背景下的 条带，较淡。
现在操作，将B液活化时间稍延长，约30秒吧，A液B液混合后30秒左右倒在膜上就可见弥漫的 荧光，压片时间一样2分钟，显影5秒后胶片同前，但均匀黑色，无条带。
园子里查相关帖子，提示抗体的 浓度太高，今天试了一个最高1：2500，一个最低1：5000的 二抗浓度，都是弥漫荧光肉眼可见。我的一抗浓度1：250，santa的
肉眼可见荧光是好还是不好，我应该怎么作，各位达人相助，谢
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发表于 2014-6-17 15:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我和你遇到同样的问题，我用的也是santa的一抗，稀释度1：100.二抗1：2000。
还有一个问题，荧光淬灭的时间是多久呢？我 用同一张膜进行了三次曝光，将发光剂用枪均匀的加在膜的正面，大概约5分钟。此时在按时肉眼观察膜上看不到任何荧光，进行曝光约10分钟，显影后可见较淡的蛋白条带，为了加强效果，进行第二次曝光，距离第一次大约20分钟，在暗室可以看见弥漫荧光，曝光后显影整个胶片是黑色的，看不见条带；第三次曝光，距离第二次大约20分钟，此时暗室观察不到膜上任何的荧光，曝光15分钟后显影胶片白茫茫一片，什么都没有，是不是在这个时间内荧光淬灭的原因呢？
你用什么封闭的，脱脂奶粉还是BSA？
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发表于 2014-6-17 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

5%脱脂奶粉1小时，目前感觉显影很恼火，影响看结果。
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fox_79[使用道具]
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发表于 2014-6-17 15:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.若膜上能看到荧光，压片时间就不用2分钟那么长了，10-30″足够！
2.转膜后是否做了立春红S染色，条带清晰否？
3.你是怎么封闭的？一抗二抗孵育多长时间？
4.肉眼若是能看到特异性条带当然是好事。
5.一抗也可以同时做1:10000的稀释。
6.我用的ECL发光液在30分钟内都可显影出条带，只是弱了许多！
愚见！
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发表于 2014-6-17 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

主要问题是荧光弥漫，这个怎么产生的呢。
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2014-6-17 15:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
"1星期前，二抗之后又杂三抗"，为何要加三抗?
分析你的情况，可能原因：一抗浓度高,过高的一抗会产生强烈的背景,不管是用BSA还是5%脱脂奶粉封闭,建议
1.降低浓度至1:1000;
2.发光剂AB混合液作用30S后,尽可能用吸水纸吸去多余液体;
3.压片时间再缩短,可以短至10s-30s;
4.在显影液里停留时间也可以短些,一出条带即中止显影.
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发表于 2014-6-17 15:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.压片30秒也做过，显影液中就全部黑影了，根本就见不到条带。
2.本人做的蛋白20KD，立春红染色后10－30KD之间条带不清晰，但1星期前是有条带出来的。
3.我的蛋白－20度保存，1星期内会降解掉吗？
4.5％脱脂奶粉室温封闭一小时，santa的一抗1：250孵育24小时或更长。二抗1：2500孵育室温1小时。
5.杂三抗是因为二抗孵育后曝片整张片子全是不透明，白乎乎的，试验员老师说是胶片曝光了。但胶片不应该有问题，试验操作中同以前一样。考虑到膜还可以利用，就杂了三抗。
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tangxin_80[使用道具]
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 小中大

1、你提的是核蛋白还是浆蛋白？用什么方法处理的？蛋白在-20度保存1星期应该不会被降解，除非提蛋白过程中有污染；其他位置的条带清晰吗？如果条带均弱，可以偿试再提一次，操作在低温下进行也很重要。如果打算多次使用，要加蛋白酶抑制剂并分装；
2、你可以增加封闭的强度，在37度1小时，以降低背景；一抗稀释度再降，如前所述；
3、判断片子有没有曝片，在压片前剪取一个角显影后定影，如果透明就没有曝光，此外，胶片没有压到膜的区域显影后也不应该是黑的；你必须确定胶片是否曝光，否则再强的条带你都看不到结果。
实验要不断偿试，不断排除干扰因素，预祝成功！
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c86v[使用道具]
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发表于 2014-6-17 15:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也碰到类似问题，我的一抗1：2000（自己制备），　二抗1：5000．我觉得你除了注意上面的前辈的问题外，可以换一换洗膜液，加强洗膜条件．例如1%NP-40,0.1%SDS, 0.5%DOC 50mM Tris,150mM Nacl.结果就很好
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moonlight45[使用道具]
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 小中大

今天下午又做了一张，一抗使用推荐浓度1：1000（只有一个推荐浓度）4度孵育48小时，TBS×10分钟×3次，二抗1：5000室温1小时，TBS×10分钟×3次，结果同前。
我提的是胞浆蛋白，冰上操作，蛋白加入裂解液和蛋白酶抑制剂，匀浆后未经过冰上静置裂解，直接12000g×30分钟×4度。
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