蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】第一次做western的问题！

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】第一次做western的问题！

join[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72960
精华 0
积分 627
帖子 873
信誉分 100
可用分 5266
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
1

发表于 2014-6-17 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】第一次做western的问题！


今天第一次做，电泳时看见预染marker的带了，电泳完后按照常规步骤浸泡膜和胶，然后进行的转膜，但是转完后膜拿下来看不见预染marker了！但是胶上的预染marker也不见了！不知道这是为什么呢？我用的是PVDF膜，我没有按照膜的说明书去配液，应该不会有影响吧？
顶部
remenb[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75236
精华 0
积分 631
帖子 941
信誉分 100
可用分 5531
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
2

发表于 2014-6-17 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那是应该没有转到膜上， 1.是不是转膜时间短了，还有PVDF膜需要处理一下，先用100%甲醇浸泡10秒左右，再用去离子水漂洗，在于TBST中缓冲一刻钟左右，不能使PVDF膜干掉，转膜液也中有SDS吗，加入SDS反而可能使转不上去
2.转膜的时候有可能短路了，膜，滤纸都要剪好一点，一般是滤纸大于膜大于胶，就不会短路
顶部
shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态 离线
3

发表于 2014-6-17 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不是转膜转反了?
顶部
join[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72960
精华 0
积分 627
帖子 873
信誉分 100
可用分 5266
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
4

发表于 2014-6-17 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有反！但是胶转完后我就用考马斯染色，然后再脱色来检查是不是转上去了，发现胶上已经没有任何蛋白条带了呀！这样看的话应该是转上去了呀！转膜时我用的恒压100v，1小时15分钟吧，蛋白是48kDa的。很奇怪的是，转膜后我用的立春红染色，没染出来，但是膜上有透明的蛋白带似的，这是怎么回事啊？我自己分析了一下，似乎是我处理膜的时候没有处理好？
顶部
dog002[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76386
精华 0
积分 916
帖子 1452
信誉分 100
可用分 8133
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态 离线
5

发表于 2014-6-17 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

PVDF膜必须用甲醇充分润湿
顶部
wood533[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76132
精华 0
积分 863
帖子 1385
信誉分 100
可用分 7745
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
6

发表于 2014-6-17 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你是不是转过拉
我用的是nc膜
20v1个小时50kd左右的蛋白已经转的很好了
不知道PVDF膜怎么需要那么大的电压和时间
建议你缩短转膜的时间和电压
再一个你转膜前是否检了跑胶情况,建议你留一半胶染色检验
如果你检验跑胶没有问题,你转膜后胶上没有了蛋白带,那就很有可能是转过了.
good luck!!!!!
顶部
join[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72960
精华 0
积分 627
帖子 873
信誉分 100
可用分 5266
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
7

发表于 2014-6-17 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢大家了！我也觉得是不是转过了呢？明天再试试吧！对了，我现在想知道用PVDF膜的时候，转膜液里面有SDS行不行啊？会使蛋白转不上去吗？
顶部
mamamiya[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72974
精华 0
积分 653
帖子 986
信誉分 100
可用分 5763
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
8

发表于 2014-6-17 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是不你的蛋白特殊啊？
我好像听一个朋友说过他的蛋白特殊，
用立春红根本染不上去色，
但是继续往下做没问题。
不知你的情况咋样？
顶部
join[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72960
精华 0
积分 627
帖子 873
信誉分 100
可用分 5266
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态 离线
9

发表于 2014-6-17 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦？是吗？应该不特殊吧？是ETEC F41黏附素
顶部
H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
10

发表于 2014-6-17 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转完膜后，胶以及PVDF膜均没法检测到蛋白条带，唯一的解释就是可能电极放反了，蛋白跑出去去了，注意膜的一面朝正极！
顶部