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标题:【求助】酵母双杂交中这样的诱饵蛋白是不是自激活？

laughing妹[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】酵母双杂交中这样的诱饵蛋白是不是自激活？


最近在做酵母双杂交，遇到一个问题，就是在将诱饵蛋白A连接到载体pGBKT7上，构建成诱饵质粒pGBKT7-A，然后转化图板，发现在缺陷型培养基SD/Trp－、SD/His－、SD/Trp－His－上都有长菌，而在SD/Ade－平板上不长菌，还没有进行下一步半乳糖苷酶显色验证，这种情况能说诱饵蛋白A具有自激活吗？如果不是这样，那么为什么会在SD/His－、SD/Trp－His－上都有长菌呢？另外，其他的两个诱饵蛋白B、C都没有这种情况，只在SD/Trp－上长菌，而不在SD/His－、SD/Trp－His－、SD/Ade－上长菌。
试验急需，希望大家能够指点一下
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orangecake[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能有his渗漏表达，你加3AT看看
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bring[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该是楼上所说的那样
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我刚准备做酵母双杂交,能否向各位高手请教呢?
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yonger[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

比如, cDNA文库是要自己构建的吗?
LexA融合质粒要怎么选择?
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发表于 2014-6-17 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看你用的质粒，估计你用的是clontech system3，宿主菌应该是AH109。
首先，你要确定一下在转化诱饵质粒pGBKT7-A前，你的空菌AH109是否验证过表型；
如果验证过表型，那就要考虑AH109的弱HIS3表达了。
因为bait蛋白内在的DNA结合性质AH109的转化子可能表现出轻微的升高的HIS3的表达。小量的3-AT一般说来足够抑制在SD/-His平板上的背景生长。然而，如果你正就HIS3和ADE2的共同表达进行选择，一般说来在最初的文库筛选时并没有必要抑制HIS3的疏漏。为了优化3-AT的浓度，将AH109转化子铺板于一系列含有不同浓度3-AT（0－15mM，例如尝试0，2.5，5，7.5，10，12.5，15）的SD/-Trp/His平板。用最低浓度的3-AT平板，该平板为一周后仅能长出小的（<1mm）克隆。培养基中有太多的3-AT能杀死新鲜的转化细胞。所以，如果你希望在文库筛选时能只选择非常强的双杂交相互作用，我们推荐在最初的铺板时同时用HIS3和ADE2报告子。（译自clontech Pretransformed Libraries User Manual PT3183-1)
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3648755[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果用SD/-Trp/-Leu/-His+适当3AT浓度筛选弱的相互作用，挑取在三缺上生长的克隆，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade上划线，我发现这样筛选到的克隆在四缺上都能生长，但是后面验证又都是假阳性，说明书上也说三缺上生长的克隆到四缺上划线，能生长就是有相互作用，我发现这种做法假阳性很高。不知道你做的结果怎样？
请问你是如何确认其为假阳性的？

[ 本帖最后由 3648755 于 2014-6-17 16:16 编辑 ]
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发表于 2014-6-17 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，非常感谢各位的帮忙，是这样的，诱饵A存在上面的情况，而B、C不存在这种情况。如果是AH109表现的His渗漏表达，那么其他的两个诱饵B、C却不存在这种情况呢？还有一点，就是对于诱饵A，在SD/Trp－和SD/His－、SD/Trp－His－上长出的菌落大小都一致，而不能在SD/Ade－的平板上生长，请问这是否可以说是诱饵A具有微弱自激活呢？
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发表于 2014-6-17 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果用SD/-Trp/-Leu/-His+适当3AT浓度筛选弱的相互作用，挑取在三缺上生长的克隆，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade上划线，我发现这样筛选到的克隆在四缺上都能生长，但是后面验证又都是假阳性，说明书上也说三缺上生长的克隆到四缺上划线，能生长就是有相互作用，我发现这种做法假阳性很高。不知道你做的结果怎样？
请问你是如何确认其为假阳性的？
三缺上得到的克隆在四缺板上划线后提酵母质粒转化E.coli，加Kan仍然能够生长，但是测序结果却是我的诱饵载体，一直都不明白，怎么诱饵载体能在Kan板生长。
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caihong[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对不起上面那个回复
我把Amp写成Kan，应该是加Amp仍然能够生长，但是测序结果却是我的诱饵载体，一直都不明白，怎么诱饵载体能在Amp板生长。
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