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标题:【求助】明胶酶图片解惑

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发表于 2014-6-17 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】明胶酶图片解惑


作明胶酶谱分析已经一个多月了，一直没有一个结果，今天跑的这个图虽然负染带较多，纵横胶片，但还是勉强能看，扫描上来又失真不少，今拿出来先描述然后请教各位，各位帮忙了，帮人一忙，胜造七级浮屠。
胶片最左边是MARK，不好意思，切胶时被毛手毛脚的师弟给MARKER切掉一多半，
勉强能看出来有3道比较亮的兰染带，最上面的是97KD，第二是66KD，下面的就不好说是多大了，因为距离已经比较远了。右边的都是跑的样品了。在97KD附近有负染带，隐约可见，97和66KD之间也有负染带的出现。现在的问题是几乎每个涌道都会出现3条负染带，但是这些带子除了92KD附近的外，位置不恒定？第二个问题更有意思，样品中有3个涌道的最下面出现比较明显的负染带，位置基本恒定在43和31KD之间（因为下面的MARKER不清楚，所以只是大概估计），请问这个负染带最可能是什么东西呢？为什么我作好几次都会出现这个带子而需要的92和72KD的带子一点都不明显呢？


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2014-6-17 16:22
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发表于 2014-6-17 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵,会不会是你的样品本身就有问题,没有你所想要的活性呢?
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发表于 2014-6-17 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不过你所提出的分子量问题我有一点看法,因为做酶谱与western等不同,蛋白不是完全变性后跑胶,做酶谱要保证酶的活性结构,没有完全将蛋白质变成一级结构一条光光的肽链,还是卷曲的,所以marker只能大概看看,不能作为分子量的标准.附上我的图片,负染带所在地方对应的分子量比实际要小,就是这个原因.
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发表于 2014-6-17 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
肿瘤
我的样本应该具有酶活性的，我用的是侵袭能力很强的肿瘤细胞株，细胞长满瓶底后收集培养液然后浓缩10倍后上样作的。
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发表于 2014-6-17 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的酶谱图片我仔细看过了，上面的MMP9分子量大小没有说的，下面这两条很靠近，但是不知道你如何确定这两条那个是proMMP2呢？MMP2酶原是72KD大小，活性形势是66KD。按照您上面的说法“负染带所在地方对应的分子量比实际要小”，那么下面最明显的那条应该是MMP2？不知道我的理解对不。谢谢！
我最近看了一片文章，专门讲MMP的酶谱的，分析了酶谱过程中出现各个带子的大小已经可能代表的物质，改天给你看看。
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发表于 2014-6-17 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是做Zymography的，我不只跑出了四条带还跑出了另外几条，现在搞不清楚那几条是什么。你们的Marker是普通的蛋白质Marker吗？Marker的缓冲液是不是不加2－巯基乙醇？还有Marker是不是要煮？我用普通的蛋白质Marker，缓冲液中没有2－巯基乙醇，煮沸了五分钟，应该有六条带，但我的胶上明显的只有三条带，所以不知道哪条是哪条，郁闷中！还有Marker是不是也一样要洗要孵育啊？
你的胶中的MMP-9是在83KD的位置，照你的意思说应该是活性型了？为什么没有酶原型呢？
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发表于 2014-6-17 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是每次都会在较靠下的位置出现一条条带，而且是只要有样品就会出现，没有样品就没有，后来我用单纯用10％的小牛血清跑了一下，结果证实是血清中的蛋白。做MMP的细胞要用没有血清的培养基养，我曾经试过，但没有血清细胞就长不好，MMP分泌量很低，后来就改为1%血清，既可以给予细胞营养产生蛋白，又对MMP的检测不会产生明显的影响。
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发表于 2014-6-17 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们跑的MARKER没有煮的直接上样，上样缓冲液和样品一样，没有加DTT和2－ME。每次MARKER都跑的少一两条，也不知道是什么原因。我们判断究竟是那一条带子只能通过观察最大的那道带子然后对着MARKER说明书根据距离寻找其它带子。
今天又作一次，感觉还不错，只是还没有照相，改天拿出来大家分析分析。
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发表于 2014-6-17 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是做肿瘤侵袭方面研究的，检测基质金属蛋白酶MMP-2 和MMP-9，但是就我所查资料来看MMP 是分泌到胞外后才具有活性，那是不是可以推断MMP在胞内没有活性，但是我用细胞裂解所得蛋白做Zymogrphy检测到了2和9，也有一篇cancer的文章是用细胞做的，也检测到了2 和9,有酶原也有活性型。MMP有酶原型活性型，又有胞内向胞外的分泌，我看的头都大了！哪位前辈好心帮我理理头绪！MMP的激活到底是什么基质？和分泌又有什么关系？跪谢！！！
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发表于 2014-6-17 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的胶想让各位前辈帮我分析分析，可我不会贴，应该怎么贴啊?
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