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标题:【求助】为什么western发光以后,marker也在胶片上

idea2011[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】为什么western发光以后,marker也在胶片上

RT,我做western时候,用ECL发光,看到目的条带,在胶片上也看到marker的条带,应该来说是看不到才对啊,我看别人做的都没有,不知道什么原因?
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说明你的marker好呗Smile,还有就是你老板有钱。
真的有这种marker的，本身不发光，但是其带有辣根过氧化物酶的或者是生物素（和链亲和素耦联）。这样在加上显影剂的时候就会发光了，不过大多国外文献用的是非发光的marker，这种产品都是在几千的，价格不菲，但是定位要正确些，我也曾经考虑过买这种，不过后来还是想到替老板省点吧。
我不知道你的是不是这种marker。请仔细看说明书。
如果不是这种marker ，那么你的实验就有问题了。看看那些带是不是真的是marker的位置，你可以把图贴出来看看嘛。
希望对你有帮助
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发表于 2014-6-17 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ritou1985 于 2014-6-17 16:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

说明你的marker好呗Smile,还有就是你老板有钱。
真的有这种marker的，本身不发光，但是其带有辣根过氧化物酶的或者是生物素（和链亲和素耦联）。这样在加上显影剂的时候就会发光了，不过大多国外文献用的是非发光的marker，这种 ...

。。。。楼主说的不是这种Marker，这种MARKER不显影才应该来求助
就是一个非特异性显色的问题
（1）加强封闭。 加大牛奶浓度至10-15%
（2）减小1、2抗浓度，自己摸
（3）加强洗脱，增加次数或延长时间
不是大问题，改进后就不会了
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是否是发光marker楼主没说哦。万一他用的是师姐师兄留给他的发光marker呢？Smile
如果是非特异性带的话，在非marker泳道中应该更容易会有杂带。
最好还是能提供图和抗体稀释后的浓度度 再分析，WB环节很多，很难说就是哪一步的问题。
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我前一段时间也遇到过这种情况，后来改进：
１）延长封闭时间，２４－４８hr,冰箱。
2）降低二抗浓度，我由2千倍摸到了现在的2万倍。
祝好运！
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看到MARKER也是正常的，你用的一抗是多克隆抗体的话就可以在胶片上看到MARKER,如果是单抗，那就不可能在胶片上看到MARKER的。
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2014-6-17 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我同意楼上的看法。我前几天刚做的WB结果很好，背景很浅没有非特异性条带，但片子上也能看到一条明显的marker条带，而且每次都能看到。我想是因为一抗是多克隆抗体，与marker里的一种已知蛋白发生抗原抗体反应所导致的。我想结果有特异性条带没有非特异性杂带就可以了，至于marker在片子上显影应该实验没什么关系吧！
再一个，我每次在转完膜后都用铅笔在膜上将marker的各个条带划一下有个痕迹好辨别，也可能这个痕迹存留一些二抗，与底物反应而发光在片子上留下影。
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