小中大Western 是一很奇怪的实验，我也遇到过，一段时间内总是花花的 影子。我做的时间挺久，曾经一段时间安把所有试剂重新配。
1.我的建议是你还可以试试 做内参的 western ，验证你的操作。 我感觉
Labvision(NMK)的β-Actin还是不错的。这样可以大概明确是不是一抗的问题。
2.发光剂我用的是PIERCE的 和Perkin Elma的。特点不大一样，前者在说明书中说的敏感度很高，其实不然，我感觉敏感度还不如PE的，PE敏感度高，但是背景也会稍高，我通过减少2 抗的量来做，把背景降低到合适的强度。
3.转瞙后不要用丽春红染色，直接用TBST洗几遍 ，开始从封闭做起。
我感觉蛋白降解的可能不大，当然不同蛋白半衰期不同，一般几个月是没有问题的。我最近做了今年一月收的蛋白，一直放在-20度，效果也还不错。
4.我是把发光剂充分预混后滴到 parafilm 瞙上（封瓶子的封口胶），然后把 瞙反扣过来。反应时间根据说明书。
5.我加一抗是把稀释液滴在NC瞙上，NC瞙放在parafilm瞙上，而不是用袋子封口（以前这么做），放到湿盒里。室温摇或者4 度过夜，抗体稀释液在加前摇震荡混匀，加到瞙上后（如果是4度过夜）要先摇匀。
