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标题:【求助】毕赤酵母表达外源蛋白，分子量变小？

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发表于 2014-6-17 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】毕赤酵母表达外源蛋白，分子量变小？


载体：pPIC9K，表达一GFP融合蛋白，GFP在目的蛋白下游，理论大小42-43kDa,但是，SDS-PAGE检测发现，蛋白表达量很高，问题1，大小与理论值差异在2-4kDa左右，问题二，条带较宽，问题三，透析后，条带位置改变，在30kDa处。
另：用E.coli表达，与理论值相符合。
分析原因
1：毕赤酵母加工，将目的蛋白N端部分序列切割。并且切割位点恒定，因为，都次发酵电泳结果基本一致。
2：表达的目的蛋白不均一，导致分子量不是很一致，但是范围恒定，所以电泳条带较宽。
3：透析过程，蛋白酶将目的蛋白C端水解，30kDa为GFP条带！
不知各位高手有什么高招？使目的蛋白表达与理论相符？
也不知道分析的是否准确，还请大家指点迷津。
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发表于 2014-6-17 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.3.4.5为发酵液上清，43kD下面的黑黑的，比较宽的条带是融合蛋白目的条带（western验证），2是透析后的样品。与另外四个样品差异很大，所以，请各位高手帮忙分析一下！多谢多谢！


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发表于 2014-6-17 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好。
本人也要做高密度发酵，要是试验中碰到什么问题，一起讨论好吗？
我感觉你的蛋白质中有二聚体。
条带宽，那是你上样量高的原因了，高密度发酵效果好，呵呵，恭喜你啦。
至于分子量降低，应该是c端降解，也有可能是n端信号肽切除不规例所致，我的蛋白拿去做n端测序总会有几个n端氨基酸降解，条带上也就有些不同了
你的发酵液中有没有添加蛋白酶抑制剂？在诱导后24小时加10酸水解酪蛋白会减少蛋白质分解，对放灌以后储藏也很有帮助。
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发表于 2014-6-17 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉的你可以在发酵液pH值及发酵时间上简单摸下条件，我做过这方面的简单研究，
我感觉这两个条件对目的蛋白的影响比较大！SDS蛋白电泳只能大概反映蛋白质的分子量！也可以比较下目的蛋白的还原和非还原电泳！
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发表于 2014-6-17 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

溶氧度影响也很大，不能忽视了，基本上溶氧度就反映了细菌生长速度和状况，甘油和甲醇的流加都要根据溶氧度来确定，而且溶氧度过低对细胞的生长有抑制作用，低于20％时细胞生长不好，但是过高的溶氧度也不好，大于60％的溶氧度就对细胞有毒害作用了。
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发表于 2014-6-17 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位，我用的是250ml三角瓶发酵，培养基BMMY，加有1.2%的酸水解酪素抑制蛋白酶。做过pH6.0,pH7.0,pH8.0，SDS-PAGE检测，还是pH6.0好些，但是差别不大。宿主菌GS115.我感觉，我的目的蛋白表达量是比较大的。减少上样量，条带仍旧较宽！应该不是上样量的问题，或许是加工不均一，在N端切割导致。
但是，透析后的蛋白，一下子便没了，可能是酸水解酪素透析掉后，不会保护目的蛋白，结果在C端也被切割。
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发表于 2014-6-17 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

也做了非还原电泳，主带是一样的。只是在66kD-97kDa处多了一条细带
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发表于 2014-6-17 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你那有别的宿主菌吗?比如蛋白酶缺失型的,若实验条件好,实验方便,还有蛋白酶缺失型的酵母宿主菌,何不转化,构件一新的菌株试试!当初我的蛋白水解也厉害,可惜实验条件一般,想做个别的宿主都难!
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 小中大
多谢提点！现有条件跟你那时候一样！呵呵
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