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标题:【求助】关于用酶谱分析来测蛋白酶活性的一个问题

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发表于 2014-6-17 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于用酶谱分析来测蛋白酶活性的一个问题


就是 如果我复性一个融合蛋白（蛋白酶）成功后准备测活，打算用酶谱分析方法来检测，不知道酶谱分析是不是只适合于明胶酶谱，还是也可以测好多其它的蛋白酶的活性？酶谱分析在分离胶中检测酶活应该是一起跑变性凝胶电泳（加了SDS)再复性显色脱色，还是先跑酶的非变性活性凝胶电泳再加底物显色脱色？
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发表于 2014-6-17 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应你一下：）
MMPs根据其结构和底物特异性不同可分为5大类：①间质胶原酶，包括MMP-1、-8、-13、-18，主要降解Ⅰ～Ⅲ型胶原及Ⅶ和Ⅹ型胶原，不能降解明胶、Ⅳ型和细胞外基质的其它蛋白成 分。胶原酶以潜酶原方式合成。MMP-1(Mr=54×103)是成纤维细胞、巨噬细胞、上皮细胞等细胞来源的成纤维细胞型胶原酶。而MMP-8(Mr=75×103)是由中性白细胞 合成分泌的中性白细胞胶 原酶；②Ⅳ型胶原酶，也叫明胶酶，包括明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B (MMP-9)。明胶酶 具 有降解变性Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原明胶的特异能力，也可切割天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型胶原；③基质溶解素，包括基质溶解素-1 (MMP- 3)、基质溶解素-2(MMP-10)和基质溶解素-3(MMP-7)；④膜型MMPs，包括MT1-MMP(MMP-14)、MT2-MMP(MMP-15)、MT3-MMP(MMP-16)以及近来分离命名的MT5-MMP。这种酶表达于细胞表面，除可直接降解基质，还对MMP-2和MMP-13有激活作用；⑤其它类，包括MMP-4、-5、-6、-20。这些未归类MMPs的作用较特殊，不能归类于其它MMPs。
所以明胶酶谱适合于做MMP2和MMP9。
至于跑胶时变不变性的问题，跑普通的SDS-PAGE胶前是加入了去垢剂和还原剂的，将蛋白的二三级结构全部打开，只保留线性的一级结构，以确保可以确定分子量的大概大小，但这样的蛋白通常失去了正常状态下的生物活性，显然对于酶谱法是不适合的。我做酶谱法时，是用非变性的上样缓冲液与样品混合后直接上样，效果很好，活性正常。跑完胶后用考马斯亮蓝染色，观察酶的活性情况。
祝实验顺利，有问题再交流：）
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发表于 2014-6-17 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上半部分有点专业看不大懂，下半部分想继续请教。如果我想做酶谱分析，底物不用gelatin而用casein，即casein zymogram,因为我的蛋白是金属蛋白酶，想用蛋白酶的通用底物casein做底物，请问，caein可不可以用gelatin替代，如果不可以，会不会因为caesin分子量比gelatin大从而在胶中扩散阻力大而影响灵敏度，如果用caesin做底物，是选用哪种，是酸化水解的还是酶化水解的还是别的类型的，跟用作封闭剂的一样吗？？问题有点多：）谢谢
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发表于 2014-6-17 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对啊，我说的MMP就是你要做的金属蛋白酶，根据不同分型选择不同底物，我没有听说caein是通用底物啊，一般经典的是检测MMP2与MMP9，用的是明胶gelatin，caein酪蛋白酶谱法可用来检测MMP3及MMP12等，所以关键还是要看你想检测的是MMP中的哪种分型。
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发表于 2014-6-17 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

酱紫的啊，如果我要检测的不是MMP中的哪种分型，不是胶原酶而是一般的蛋白酶呢，可不可以用这个方法？
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发表于 2014-6-17 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目前这种方法主要用来测MMP，别的蛋白酶我还没有看到相关报道
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发表于 2014-6-17 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

casin 也是一种很常用的底物啊，主要还是看你的蛋白的性质，就算是普通蛋白酶也有好多种，到底多普通？casin也同明胶一样走酶谱的。
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发表于 2014-6-17 18:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
越听越迷糊了，我的序列比对属于嗜热菌蛋白酶家族，它有一特异性底物叫脑啡肽的五肽（enkephalin),由于订这个东西挺麻烦也贵，所以我想先用蛋白酶的通用底物casein 做casein zymogram，看有没有活性，不知道可不可以？？或者跑天然活性胶更好些？
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