蛋白质与蛋白组学

战友别客气，互相帮忙。
对于人源性的细胞来说，囊泡的分离有两种办法。如果囊泡位于细胞内部，那么首先裂解细胞，使得囊泡能够释放到细胞外。然后，任何含有质膜的囊泡性结构在100000g的超速离心下可以沉淀下来。如果囊泡分泌到细胞外，比如培养液中，那么直接将培养液离心就能沉淀囊泡。
离心力的选择很重要，一般而言，300－500g能够使细胞沉淀，800g能够沉淀细胞碎片，5000－10000g左右能够沉淀线粒体、高尔基体、过氧物酶体等质膜结构的囊性细胞器。但是，如果是质膜结构的囊泡性结构，则需要100000－110000g的离心力。再大就会有蛋白质复合体、核酸什么的沉淀了。我做人腹水中的一种细胞分泌的小囊泡，直径50－100nm，就是用100000g离心1小时得到。这时仍混有一些杂质，但纯度还可以。
得到囊泡后，关键是你不知道需要什么蛋白。你可以将囊泡用非离子去垢剂（如尿素、CHAPS）使质膜溶解，然后将膜蛋白进行双向电泳，再用质谱鉴定都有那些蛋白。找到你感兴趣的蛋白后，在做下一步研究。
最后一个问题不懂，请别的战友回答。

纯度鉴定可以现在电镜下看一看杂质有多少，大概估计一下纯度。然后需要知道可能会有哪些杂质，比如线粒体碎片，那么用western看看有没有线粒体特异的膜蛋白。这一点挺难的，因为可能我们根本不知道杂质会是什么，或者杂质没有特异蛋白。还有一种办法，就是知道那种囊泡有没有肯定不出现的蛋白，而别的杂质含有的蛋白，那么用western测一下那种蛋白就行。比如在我的实验中，分离的囊泡在50kd以下的区段是没有泛素表达的，而泛素是细胞内广泛出现的蛋白，所以我就测有没有泛素，如果有，那么将泛素的浓度和总蛋白浓度一比，就知道杂质的含量了。别的办法我也没有了，问问别的大侠吧。
还有，所谓纯度只能是一个相对的概念，不可能百分之百纯。我想最重要的还是要知道离心后一道沉淀的都是些什么东西，如果用100000g离心，在人类细胞绝大多数都是质膜囊泡，有少部分的细胞膜碎片、凋亡小体、线粒体碎片、内质网碎片。其实，如果你将沉淀全部作质谱，那么就大概知道都有那些膜相关或者膜特异蛋白了。
50nm100000g应该可以了，300nm可能不需要那么大就能沉淀，这取决于两者的沉降系数，直径的影响不是主要的。说白了，越重越容易沉淀。还要考虑的是离心时间，我用1小时就够了，但是也有离心过夜的，这个你得查查文献了。或者自己用不同得时间试一试。如果你知道待分离囊泡的密度，那么使用密度梯度离心可以将纯度大大提高。另外，离心时一定要小于等于4度，不然蛋白容易降解。
祝顺利