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标题:【求助】有关Western blot的几个问题

tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-6-17 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】有关Western blot的几个问题


我有几个问题请教各位大虾：
我的蛋白分子量是72－74KD，我用的是湿转法，100mA，3个小时。我也有一次用了2.5个小时，我用考马斯亮兰染了胶胶上没有什么条带，我以为都转上了。可我用ECL发光，最后暴光时蛋白浓度基本一致的标本，有的能爆出条带，有的却没有条带，蛋白浓度小的标本基本没有条带，我同学说我转膜的时间太长了，以致于有些蛋白被转没了，是这样的吗？如果与转膜时间有关的话，那象我的蛋白这样大的分子量应改转多长时间呢？
用Western blot检测蛋白，蛋白浓度最低是多少能成功爆出条带来呢？因为我的蛋白浓度比较低，有的只有0.1ug/ul左右，一直暴光不成功，髙浓度的可以爆出来。
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-6-17 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看完后全篇话后，才发现你最关键的是最后一句 “低的只有0.1ug/ul左右，髙浓度的可以爆出来”
这么说你的电泳、转膜、一抗、二抗的孵育一般都没大的问题，因为你高浓度的可以暴出来。虽说Western blot号称ng都能显现出来，但是小于0.1ug就不好做了
（1）浓缩蛋白，用超滤离心管浓缩蛋白比较简单，我自己浓缩到10倍过，顺便多加几次PBS除盐。
（2）加大一抗、二抗浓度
（3）70kd的蛋白若是湿转的话，推荐你尝试一下恒压法，100V/70至80分钟，绝对没问题。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-6-17 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜的时间会有什么问题吗？
会转没 ？
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-6-17 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜时间太长会转没掉的
蛋白穿过膜进入转膜缓冲液了
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发表于 2014-6-17 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

70kd的蛋白不会轻易转没的.你的膜是0.45的吗?时间稍长应该不会转过
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发表于 2014-6-17 18:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们转膜：15伏30分钟！
转完后用丽春红染！最好点个marker就可以看你转的效率了！
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发表于 2014-6-17 18:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们湿转30v，4度过夜，效果也不错。我觉得你主要是蛋白浓度太低，可以浓缩样品后上样。
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2014-6-17 18:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你所说的“用超滤离心管浓缩蛋白”，能说的详细点吗？具体的 操作步骤能否详述？多谢！
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-6-17 18:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没问题！
超滤是一种比较简便的蛋白浓缩方式。 你的蛋白是72kd左右吧，购买或借到100KD和30kd或10kd的超滤离心管。先在离心机上使用100KD的超滤离心管对样品进行离心，4000rpm/30min，你会看到有很大一部分液体漏下去了，你的70多KD的蛋白就在里面，弃去离心管上部的液体（大于100kd），再次用30kd或10kd离心，这次要的是离心管内的东西，弃去漏下去的液体，多做几遍，就可以达到浓缩的效果
但是，这种方法是有损耗的！ ！得率与转速/离心时间/超滤离心管规格有关系的。
进口超滤离心管比较贵，一个大约30-40块，而且一买就是一袋或者8个。最好能借到
比如说这个超滤离心管
cuturl('http://www.bio-equip.com/show1equip.asp?equipid=59674&division=2403')
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蒲公英[使用道具]
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 小中大

浓缩一下，如果蛋白纯度可以的话，0.1ug/ul应该可以爆出来，你最好加大一抗二抗的浓度，同时延长孵育时间
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