【求助】his-tag resin 无法结合目的蛋白！

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标题:【求助】his-tag resin 无法结合目的蛋白！

079777chao[使用道具]
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发表于 2014-6-17 18:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位侠，小弟碰到棘手问题了，希望大家给点意见。
我是用毕赤酵母进行高密度发酵的表皮生长因子，发酵液离心后，收集上清，然后过histag柱，但是怎么样都结合不上去，跑sds－page时，看到虑过液中的目的蛋白非常多，跟上清的几乎一样，而洗脱液中量少的可怜，，只有很模糊的蛋白条带，wash buffer和bind buffer过柱后的液体检查没有目的蛋白
原因一定是没有结合上去
后来我把ph调到7.8，另外一批进行透析后上柱，结果还是不能结合上去，透析的目的蛋白也不见了
我自己分析一下原因，可能有几个1，his tag树脂不行，我用重生柱的，按照说明书进行（不知道大家用的是什么样的流程重生，我的是先用离子化缓冲液过柱，bindbuffer平衡后就加液体，采取了连续流过的方法，一次性过几十毫升）；2，上清中盐离子浓度太高，初步算了一下，达到0.4mol的盐离子浓度；3，目的蛋白分解，可能六个his部分有损伤，导致结合不上去。
大家有什么好的建议啊，指导可怜的孩子吧，呜呜

yychen[使用道具]
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发表于 2014-6-17 18:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1,也许填料的配基密度不够,或者作用力太弱,一般说来填料的颜色越深,配基密度越大,作用力越强,所以有时候选择强的就能挂上.
2.盐不影响吸附,除非是高浓度的铵盐,3,目标蛋白的标签不充分暴露,难结合,只能在变性条件下做看看.

NBA[使用道具]
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发表于 2014-6-17 18:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

除了您自己和c楼上战友提到的一些原因以外，是不是应该考虑蛋白降解的问题。
如果人家文献上有过报道的话严格按文献上说的做做看。
如果自己摸索条件，除了上面的建议，能否考虑加多种蛋白酶抑制剂比如PMSF、PepstatinA、Leupeptin、Aprotinin等？还有就是洗脱后马上煮样电泳看看（虽然有midazole不太好点，呵呵）
还好这个纯化过程不是很复杂，祝好运～

wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-6-17 18:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

根据我们实验室的经验，这种情况一般都是蛋白C末端降解造成的，因为Ni亲和纯化操作很简易，不太可能有问题。

lxh031[使用道具]
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发表于 2014-6-17 18:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

将滤过液作Western看一下是否能够与抗His抗体识别就能判断是否有降解。
上样时一定要放慢流速以保证充分的结合时间或者直接在室温将凝胶与样品缓慢搅拌混匀，然后再上柱。

079777chao[使用道具]
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