【求助】溴酚兰以上部分银染背景太高的原因？

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标题:【求助】溴酚兰以上部分银染背景太高的原因？

fox_79[使用道具]
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发表于 2014-6-18 10:48 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天做银染，用的配方和试剂都是以前的，以前好好的现在却出现了问题：溴酚兰以上部分银染背景很高，显示2分钟就很黑了，只有几个大的点显出，小点没来得及显出就被黑背景给掩盖了。
因为溴酚兰以下是没有问题的（背景很低），所以没有考虑是银染操作和试剂的问题。
与以往的差别有：
重新配了水化液。2向SDS-PAGE时产热厉害（玻板一边破裂，没有接恒温书水浴）。
请高手指点可能的原因，谢谢！

yes4[使用道具]
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发表于 2014-6-18 10:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可能是电极buffer不太干净，应该与发热没什么关系，最好贴上图，再说说你的具体条件。

fox_79[使用道具]
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发表于 2014-6-18 10:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #2 yes4 的帖子

, 是新配的电泳缓冲液. 倒是配好放了几天再用的.
扫描仪坏了,还没修回来,图没法贴.
用了Bio-rad 的 PROTEAN II xi 二向电泳仪. 电压80V 45min, 200V, Unlimited(实际跑了5:30h)
不知道跟这个有关的具体条件包括哪些?还请指点

yes4[使用道具]
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发表于 2014-6-18 10:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用同样的电泳仪的条件：先4mA/胶进样30-40分钟,然后25mA/胶跑4小时40分钟,没用恒温水浴,或者在层析柜中跑。

fox_79[使用道具]
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发表于 2014-6-18 10:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果没有放层析柜中跑,电泳完有没有觉得玻璃都是烫的?
前几天气温高,跑完玻璃一边都裂了.
电泳没有冷凝的话,对电泳结果有什么影响吗?

yes4[使用道具]
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发表于 2014-6-18 10:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

个月前我在室温下、未用了恒温水浴的情况下跑过几块，玻璃是热的，但不烫。跑胶条件和我以上说的几乎一样。
电泳没有冷凝的话,对电泳的影响应该就是所谓的微笑现象。但是我觉得不是个很严重。另外可能还有可能促进蛋白点的扩散。

gogo[使用道具]
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发表于 2014-6-18 10:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1."2向SDS-PAGE时产热厉害" ----可使蛋白扩散
2.银染试剂的量和时间要精确,有时多几秒就不好
3.提前终止.个人感觉加终止液后胶还是会缓慢显色约1min的

fox_79[使用道具]
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发表于 2014-6-18 10:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请看这副图,因为同一胶,溴酚蓝以下部位没有染黑,所以,跟银染时间,用量和终止都没有关系.而且,所用的染色条件和我原来染出是好的条件是一致的.
加在旁边的marker部位也被染成黑色,所以跟一向没有关系.
自己分析可能的原因是:电泳缓冲液, 封胶用琼脂糖凝胶或电泳产热有关系. 希望有相关经验的战友提供帮助.谢谢