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标题:【求助】WB一抗错误稀释问题

TAT[使用道具]
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发表于 2014-6-18 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WB一抗错误稀释问题


小弟做WB时错误将一抗用PBS稀释（原液为PBS溶液），请问还能用于WB吗？为什么一抗要用封闭液稀释？
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-6-18 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用TBST稀释，加0.02%小牛血清。
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zzzz[使用道具]
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发表于 2014-6-18 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这样可能会导致背景过高，不过你可以试试！实验就是这样的，得试才行
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-18 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为稀释的时候用PBS和用PBST都是可以的
可能背景不是那么干净，但是不影响抗体结合
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2014-6-18 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

没问题!大胆作!一抗孵育完用PBST洗10次,3in/次,继续往下做就OK了!
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68943512yao[使用道具]
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发表于 2014-6-18 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不用用封闭液稀释
用tbst稀释就可以了
问题不大
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-6-18 11:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该问题不大，我做ELISA的时候就用过PBS稀释过抗体，没问题。
个人觉得，tween起到解离轻微结合的蛋白和杂质，pbs起到保证 protein 正确构向的作用，实验核心并不在tween,大可放心。
上面战士提到背景可能加深完全正确，因为我做ELISA就有对比，pbs与封闭液稀释会有点差异，但决不是关键问题。
好运！
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-6-18 11:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

忘了，至于你提到“为什么一抗要用封闭液稀释？”
wb中同时有tween or BSA...我觉得是在解离结合能力不高蛋白的同时用非特异性蛋白使未结合目的蛋白位点饱和，特异性更强。要知道一般bsa浓度会远大于抗体浓度。
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-6-18 11:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用过几种一抗稀释液
1，5%脱脂奶。
2，3%BSA。
3，5%BSA。
以上都可用PBS配，也可用TBST配。个人经验为，抗体背景高时用脱脂奶好；抗体质量好背景低时用BSA配，效价高可节约抗体。
所以，用PBS稀释了没关系，再加入相应脱脂奶粉或BSA即可。
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