小中大我想问一下,使用PEG8000纯化完成以后不是应该只有一条条带的吗?今天我又提了一次,量是上去了,可是既然出现了两条条带,不是应该全部是超螺旋吗?以下是我的操作方法Sad园内搜索到的)
一种快速大量提取质粒的方法
TB配制（500ml/瓶）
bacto-tryptone 6 g，bacto-yeast extract 12 g，甘油2 ml，加H2O定容至450ml。
磷酸缓冲液（100ml/瓶）:
KH2PO4 2.31g，K2HPO4`3H2O 16.43 g，加H2O至总体积为100 ml。
分开灭菌121℃湿热灭菌20min，待温度降至60℃后再加入50ml磷酸缓冲液，混匀。
质粒抽提溶液（I,II,III,IV）
Solution I配制（1000ml/瓶）
Tris-HCl (pH8.0)Sad1M Tris-HCl pH8.0)50 ml，EDTA: (0.5M EDTA pH8.0)20 ml，加ddH2O定容至1000 ml。
附：1M Tris-HCl (pH8.0)配制（500ml/瓶）
Tris-base称量60.5g，加H2O400ml溶解，加入HCl 42ml后，继续用HCl调pH至8.0，加ddH2O定容至500ml。
0.5M EDTA (pH8.0)配制（500ml/瓶）
EDTA钠盐 93.06g、NaOH10g，加H2O400ml溶解，用1N NaOH调pH至8.0，最后定容至500ml。
Solution II配制
使用前新鲜配制：
miniprep:200ul/管：10M NaOH 4 ul，10% SDS 20 ul，ddH2O176 ul。
macroprep:10ml/管：10M NaOH 200 ul，10% SDS 1000 ul，ddH2O 8.8 ml。
10M NaOH 配制：500ml (装于塑料瓶中) 称NaOH 200 g
10% SDS 配制：500ml 称SDS 50 g（加热溶解）
Solution III配制（1000ml/瓶）
5M KAc 600 ml，冰醋酸115 ml，ddH2O 285 ml。
Solution IV配制（200ml/瓶）
NaCl 18.7g，PEG-6000称量26g，加ddH2O定容至200ml。
TE 配制（500ml/瓶）
Tris-HCl (1M Tris-HCl pH8.0)5ml，EDTA (0.5M EDTA pH8.0)1ml，加ddH2O定容至494ml。
RTE配制（50ml/管）
TE 49.5ml，分装好的RNase(10mg/ml) 0.5ml。
实验步骤：
1、接种200ul菌种于30ml 的TB中，37℃，300rpm的摇床中培养过夜；
2、将菌倒入50ml的离心管，4℃离心10min，弃上清，加入5ml溶液I，剧烈震荡混匀；
3、加入10ml溶液II，轻轻颠倒混匀；
4、加入7.5ml的溶液III，混匀后4℃，4000rpm离心10min；
5、上清通过两层纱布过滤到一洁净的50ml离心管中，然后加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后4℃，4000rpm离心15min；
6、弃上清，沉淀中加入1ml含有0.1mg/ml的RNA酶的TE，放入37℃-55℃水浴30min；
7、加入1ml 溶液IV，混匀后4℃，4000rpm离心15min；
8、弃上清，沉淀加入0.4mlTE，溶解后加入等体积的酚/氯仿，混匀后室温12000rpm离心4min；
9、将上清移入一新的洁净Eppendorf管中，用酚/氯仿重复抽提一次；
10、上清中加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后室温12000rpm离心4min；
11、沉淀用75%乙醇洗涤一遍，溶于0.2-0.4mlTE中，65℃放置10min，测定OD值。4℃冻存备用。
