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标题:【求助】western封闭液

leifengta[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western封闭液


请问一下，如果western中使用的5%脱脂奶粉封闭液不是用TBST稀释的，而
是用水稀释的，一抗二抗也是用该封闭液稀释的，会有什么后果？
对结果会有何影响？
谢谢！
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我认为不会有影响。我做的western中使用的封闭液是1%的BSA,就是用水稀释的，一抗二抗也是用该封闭液稀释的，效果很好！
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leifengta[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我一直都用的水配5%的脱脂奶粉，一抗二抗也是用该封闭液稀释，结果还
好，但是每次都有很多非特异条带，今天同学看到我配的时候才告诉我应该
用TBST，晕。。。
如此操作是否会增加非特异条带，是否会影响抗原抗体反应？
怎么办呀，现在好着急啊
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BOSS2011[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那就改为TBST或者PBST（PBS加Tween20），具体会有什么影响还不是很清楚。但是有一点是可以肯定的，溶液的PH值和离子强度是会影响抗体活性的。而且封闭液中加入的Tween20可以增强封闭效果。
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Tween20是增加抗体和蛋白结合的特异性的
在封闭时不加也没什么影响
我封闭液就是用去离子水配的,过夜封闭
效果不错
在杂交的时候稀释一抗和二抗用的是TBST
二抗杂交时加适量的脱脂乳(大约5%)
如果不是你抗体本身的问题(特异性不好,浓度过高),一般这样就可以了
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remonte[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果有非特异条带出现，是不是一抗，二抗作用时间太长了？！抗体作用的时间过长会引起非特异性吸附。我的一抗，二抗作用时间均为室温，摇床1小时
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applebook=213[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有啊，可能是二抗放的时间太久了，买新的试试吧。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们的做法是5%脱脂奶粉用1*TBST稀释的，一抗、二抗也用该封闭液稀释，效果不错！你试试看。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

但是你如果做到磷酸化项目时，就不能用牛奶了，要用BSA，因为牛奶里含有一些磷酸化酶。
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98776langtao[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也按你的方法做过,没问题!
不过这要看运气了,高丰度蛋白影响不大!
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