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标题:【求助】western背景总是很深

bring[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

背景深主要有两个原因，一是封闭不足，我们实验室常规是5－10％脱脂奶粉室温封闭3小时或4度封闭过夜。另一个问题就是洗膜不充分，如果封闭、一抗、二抗的原因你都注意了，但是背景还是很深，就应该适当增加洗膜液中的盐浓度或洗膜次数，我们实验室洗膜液中NaCl是500mM，一抗作用完毕后洗膜20min，二抗作用完毕后洗膜35min，背景非常干净。
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lxh031[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

洗得不完全吧，背景都是非特异性的结合
一抗，二抗都要用封闭液进行稀释
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发表于 2014-6-18 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢各位的帮忙，我做了几次总有两条杂代出现，我用的是santa cruz的一抗，蛋白是tubulin，不知有没有人做过，能不能是抗体的问题？还是蛋白本身由于自身的结构容易出现杂代？

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可能跟抗体有一定关系吧？我们实验室做的是α－tubulin，从sigma买的，从来没有杂带，推荐1：5000，用到1：10000还是相当的好，条带亮且单一。
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发表于 2014-6-18 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位帮忙，刚才看了个帖子，是不是与二抗标记有关，我二抗是用碱性磷酸酶标记的，我做的背景深不知与这有没有关系？而且我用变性胶跑得，应该杂交后分子量应与单体的大小相当，可是我做的蛋白大小却与二聚体的大小相似，不知是何原因？又要麻烦各位了！
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发表于 2014-6-18 17:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这是最近做的持家蛋白tubulin试验照片，比以前好一些，但还是有一些杂带，而且预染marker带（天为）总是比较宽，不知什么原因？请各位帮忙！


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发表于 2014-6-18 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一抗santa cruz，二抗santa cruz（碱性磷酸酶标记），5％脱脂奶粉封闭过夜，一抗1:250孵育1小时，TTBS洗三次，每次10分钟，二抗1:2500孵育2小时，TTBS洗三次，每次10分钟。显色（天为BCIP/NBT试剂盒）。右边第一条带预染marker，右第二条普通marker，立春红染色。预染marker跑了几次总是这样，是不是marker有问题啊！
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
背景的颜色和一抗的质量和二抗的浓度有关!
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发表于 2014-6-18 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
背景很黑，可能多是抗体问题，特异性差，我们实验室也买了santa cruz的几个抗体，都出现同样问题，和公司交涉后退货了，所以买抗体是要慎重！！！
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发表于 2014-6-18 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位的指教！那怎么办？它也出带难道真是抗体的问题？还有预染marker怎么带这么粗？santa cruz的抗体很差吗？我看文献都用这个公司的，再摸摸条件不知能行吗？
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-18 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可提高TBST中tween的浓度，一般为0.1％,可增至0.2％。
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