蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】蛋白电泳图

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 14  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】蛋白电泳图

12xunmei[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108881
精华 0
积分 294
帖子 247
信誉分 100
可用分 1937
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
1

发表于 2014-6-18 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白电泳图


我跑得精子蛋白图片，最大的问题是酸性端和碱性端出现了云雾状的现象，
蛋白点分辨不清，做了好几次都是这样。
我用的是13cm胶条，55000聚焦，先用尿素裂解液提取，离心后，沉淀用盐酸胍裂解液提取，cleanup提纯，离心上样，实在不知道出现了什么问题，
有经验的同学请帮我指点迷津，在此谢过。


查看积分策略说明
附件
2014-6-18 17:53
95480709.snap.jpg (39.83 KB)
 
顶部
vvmmoy[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79224
精华 0
积分 825
帖子 1270
信誉分 100
可用分 7255
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-8
状态 离线
2

发表于 2014-6-18 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样量是多少，好像看上去上多了
有没有加蛋白酶抑制剂？
离心得转速是多少？是不是离心的速度不够大，时间不够长？
顶部
yychen[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77452
精华 0
积分 516
帖子 751
信誉分 100
可用分 4495
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
3

发表于 2014-6-18 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

银染时间过长。
背景颜色深可能是胶上沾了杂质，尽量不要用手接触。
上样量偏大
顶部
12xunmei[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108881
精华 0
积分 294
帖子 247
信誉分 100
可用分 1937
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
4

发表于 2014-6-18 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 vvmmoy 于 2014-6-18 17:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

上样量是多少，好像看上去上多了
有没有加蛋白酶抑制剂？
离心得转速是多少？是不是离心的速度不够大，时间不够长？

上样量50微克，蛋白酶抑制剂也加了
4万g离心，40分钟
顶部
12xunmei[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108881
精华 0
积分 294
帖子 247
信誉分 100
可用分 1937
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
5

发表于 2014-6-18 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 yychen 于 2014-6-18 17:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

银染时间过长。
背景颜色深可能是胶上沾了杂质，尽量不要用手接触。
上样量偏大

银染为4分钟
胶上确实有杂质，但如何才能不用手接触胶啊
银染容器应该用什么，一般的好像都是自制的吧
您是怎么做的呢
顶部
yychen[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77452
精华 0
积分 516
帖子 751
信誉分 100
可用分 4495
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
6

发表于 2014-6-18 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #5 12xunmei 的帖子

银染没有固定时间，看显色程度可以就应该停止了。
在倒液体时，尽量和胶接触面小，可以用手指固定一角，慢慢到出液体。有一种槽子，本身有出水口，这样就避免用手接触了。
顶部
memory[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
7

发表于 2014-6-18 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看你的上样量和离心都没有什么问题，是不是跟你的样品有关系？
我猜想精子的成分比较复杂，脂质比较多，还有精液会不会也夹杂在你的提取液中呢？
顶部
12xunmei[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108881
精华 0
积分 294
帖子 247
信誉分 100
可用分 1937
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
8

发表于 2014-6-18 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

精子的成分确实比较复杂，但是精液不会在提取液中，因为进行了二步提取
顶部
memory[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态 离线
9

发表于 2014-6-18 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

背景颜色深可能跟你用的水和银染试剂有关系。水最好是miliq的超纯水，试剂中不能有杂质，都用分析纯的。
银染的时候带手套就好了啊，容器用玻璃器皿就好了，我们组盛胶的是办公用的抽屉，塑料的，比较好用。
还有你可以尝试下加大cleanup试剂的用量，如果样品中核酸，脂质成分多的话会堵塞SDS－PAGE的孔径，然后蛋白没有办法分开，就扎堆成糊状了
顶部
12xunmei[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108881
精华 0
积分 294
帖子 247
信誉分 100
可用分 1937
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
10

发表于 2014-6-18 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #9 memory 的帖子

水是miliq的超纯水，试剂中都用分析纯的，都是进口的
不知道北京哪里能买到办公用的抽屉，您位置是否在北京，能否告知具体地址我们已经买了很久，但没有买到合适的抽屉
样品经cleanup提取后用超声处理过，不应再有核酸
不知脂质成分如何能够去除？
顶部
 14  1/2 12››