【求助】western一片空白

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标题:【求助】western一片空白

pou[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我连续做了好几次western检测磷酸化的JNK，最后显色都是一片空白！请大家帮我分析一下原因。
我用100ul上样缓冲液裂解细胞（估计数量为3*10^6),裂解后煮3min，12％胶每孔上样20ul，我的目的蛋白为45kD，电泳后100V湿转60min，5％奶粉封闭1h，封闭液稀释一抗1：2000，4度过夜。TBST洗涤后二抗孵育1h，用Pierce的Super signal显色后，膜上不见发光，压片后一片空白。
电泳时用了NEB的预染marker，转膜后marker清晰可见，丽春红染色显示蛋白带状分界不清楚，只显示为一条红色的泳道。后来换了半干转，也是同样的颜色。
我把二抗跟发光试剂混合，有荧光产生。
一抗为cell signaling的鼠源单克隆抗体，
二抗为中山分装的羊抗鼠IgG。
在裂解细胞前我加了康成公司产的蛋白酶和磷酸酶cocktails，
按道理，我的上样量也不少啊，怎么将NC膜染色后不呈条带状呢？难道是蛋白降解了吗？
还是一抗失效？
哪位高手帮我分析一下原因如何？先谢谢啦

fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先确定蛋白量有没有问题，上样考染一张胶，然后再跑一张胶转膜，100v 90min（一小时有点短），丽春红染色，看一下膜上的蛋白量，脱色后可进行Western而不影响结果。有的时候Marker很清楚但蛋白转过去的很少，因为蛋白量少。如果上面的都没问题，就考虑一抗、二抗加量。
对了，显色前膜不要完全弄干，影响显色。

xue258[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上说的很对
我想补充一点:
你跑胶的浓度是多少
建议加长浓缩胶和加大分离胶浓度

pou[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是12％的分离胶。
另外我用的是抗磷酸化位点的单克隆抗体，是不是在敏感性方面要低于多抗？
我买的是cell signaling的原装抗体，一抗失效的可能性应该不大吧？我一直放在-20度储存。如果一抗失效，不知用什么方法来鉴定呢？

fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

抗体说明书上写可放－20就没问题，如果说不行千万别放！如果是膜蛋白，可用流式细胞仪鉴定就行，买一只FITC标记的二抗，100元左右，用鼠源细胞做一下流式鉴定，看一下标记效率。前题是找个有经验的人帮你做流式，标记步骤最好有经验的人做，不要出错，否则最后就不好找原因了。还有，做磷酸化的最好用PBST，就是PBS加吐温（0.05-0.1％）。
我觉得先确定蛋白和转膜问题，然后抗体调到1：500，做做再说，不一定是抗体的问题。

pou[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

又重复了一次，显影后还是一片空白，
转膜的条件我也反复摸索了3次，
90V 湿转60min
90V 湿转90min
90V 湿转120min
不管如何转膜条件，转完膜后立春红染色发现仍然只显示为红色的泳道！并没有蛋白条带！
我是用SDS sample buffer裂解5ml THP-1细胞（悬浮细胞，估计有4×10^6).
裂解液配方为62.5mM Tris-HCl(pH 6.8)
2% SDS
10% 甘油
50mM DTT
0.01％溴酚蓝
药物处理完细胞后，用冰冷的PBS洗涤一次，离心后加入100ul该裂解液，同时每1ml裂解液中加入5ul康成公司产的蛋白酶抑制剂和5ul磷酸酶抑制剂。加入裂解液后迅速置于冰上，煮沸3min，超声处理5s后取20ul上样。我的目的蛋白是45kD,12％的胶（跟文献上的一致）。
转膜缓冲液：
甘氨酸2.9g，
Tris5.8g，
SDS 0.37g
甲醇200ml
加水至1000ml
转膜时使用冰袋
以下是我用凝胶成像系统拍下来的转膜后的图片，第一泳道是预染marker（转膜后很清楚），第2－6泳道为目的泳道
转膜前我另外跑了一块胶，拷染发现有明显的条带（虽然条带不是很多），而非转膜后这种没有任何条带的情形。
我现在不知道哪一步出了问题。难道是在转膜过程中蛋白降解了吗？麻烦各位高手帮我分析下原因，实验紧急，感谢不尽！

附件

2014-6-18 18:08

15811663.jpg (16.45 KB)

fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有三点建议
1.蛋白量小，应该增加上样量，因为你提到考染仅有少量条带。有可能上样量小，转膜后再损失，导致蛋白转至膜上的就更少了。
2. 电转液新鲜配，确认不要搞错了瓶子，误把电极缓冲液当成了电转液，这样的话Marker还是可以被转过去的，但膜上的蛋白就模糊一片了，也有可能问题在这里。
3 .试试100mA过夜转,转得更完全.
总的来说问题在转膜之前,集中力量把这里的问题解决,不要浪费时间把后面的步骤也一遍一遍的做.祝好运!

pou[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我这两天转膜发现了一个很奇怪的事情：
我用同学的NC膜，今天湿转换成了150mA，180min（电压大约80V)
发现，NC膜上的乳白色背景居然有脱落现象！这怎么回事啊？是不是膜有问题啊？
我将膜用凝胶成像系统拍下来了（图中黑色部分为NC膜的正常乳白色背景，白色部分就是有脱落现象的地方）
另外可不可以告诉我你的email啊，我还有大量的问题想向你请教呢。

附件

2014-6-18 18:09

12468548.snap.jpg (84.73 KB)

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发表于 2014-6-18 18:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我觉得是不是你样品裂解的原因啊，你试着沸水裂解10 min，然后上样前离心下，取上清上样，这样SDS-PAGE上的图会好看些

jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

赞成h2o的说法，细胞样品跑电泳的时候，经常会样品溶解不完全。增加裂解液中的SDS量（加倍），可能会有效果。
另外，增加一抗的量可能会有效。