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标题:【求助】抗体不出结果的原因？

ns5fan[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】抗体不出结果的原因？


我是直接从国外订购的抗体，冻干粉剂，先用去离子水配成0.2ml的原液。免疫组化染色用。
因为抗体得来不易，我极为小心，之前也在园内求助过，得到了几位战友的帮助，但最终未能像他们所介绍的那样先离心再配液。加入去离子水后我也未敢剧烈摇晃，便取出50ul准备先分装，但发现50ul太少，便1：10稀释后再分装。最后使用的浓度为1：500（说明书推荐为1：200，但我曾用1：500染出来过）。
同时做的还有另两个抗体，结果基本都出来了，就是我最关心的这个抗体染不出来。我又做了一遍，仍是如此。
目前剩下的150ul原液我没有分装（当时配抗体的时候真是太乱了，实在想不清楚，头都大了，算术也都不会做了-_-|||），加了等体积甘油放在-20度。我没有分装的原因是，特别害怕分装时候浪费抗体~~~
请各位大大帮我分析一下，染不出结果的原因可能是什么呢？下一步我该怎么做呢？
谢谢了！
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同时做的还有另两个抗体，结果基本都出来了.........................Do you did the
same procedure as that antibody? If the answer is "yes", maybe your antibody was
not good, go back to check with that company or ask them send a specialist to do it
for you.
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ns5fan[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

yes, absolutely the same procedure.
The problem is, the first time I applied the antibody, it worked well at 1:500.
So now I'm bewildered, don't know which step was wrong.
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ns5fan[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Oh I forgot to say "the first time" I borrowed an aliquot from other.
If the answer is "yes", maybe your antibody was
not good, go back to check with that company or ask them send a specialist to do it
for you.
Could that be true? Asking them send a specialist to do it for me? Then how much should I pay……
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雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

染不出色的原因太多了!!
1:500那次完全有可能是非特异带 既然推荐1:200 你再用1:200试试 记住一抗是可以使用数次的,别用了一次就仍了. 加入叠氮钠可以保存更长时间.
样品的制备(降解)\电泳\转膜里面都有可能出问题,你不能只是怀疑一抗
1.如果没加蛋白酶抑制剂,你的样品可能降解,需要重新提蛋白
2.转膜后用立春红染过没有? 有可能转膜就没成功呢?
你的提问太广泛,需要更加细化才能更好的想出针对性的对策
大胆地做吧!
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ns5fan[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的热心帮助。
如果一抗在室温下反应过夜了，留下来还能下次继续用吗？（刚好反应的那两天气温比较高）
你说的后面几个问题指的是WB吧，而我做的是冰冻切片的免疫组化染色，暂时不存在你说的几个问题。请你继续指教，谢谢！
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standbyme[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Your last experiment antibody was borrowed from other people, so did these two antibodiesw came from same company, if they did, did they has same lot number. Also increase your Concentration also is a good idea.
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2014-6-18 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

只能加大抗体的浓度了。1比200，一比100。先试一试。如果第一次是一次非特异性染色的话，你核对一下二抗和一抗是否匹配。该注意的问题太多了，千万不能让片子干了。
另外，可以延长一抗孵育时间，24或者48 四度过夜效果更好些。
另
你不能稀释后再分装的。应该一次性把所有抗体分装成小份。
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