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标题:【求助】蛋白分子量与预期不符

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发表于 2014-6-19 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白分子量与预期不符


我表达的GST融合蛋白比预期的偏小一点，好像大了10kD，我计算的融合蛋白大小为87kD，在电泳中接近66kD的蛋白marker，这种现象可能出现吗？有没有看过介绍蛋白大小与分子量标准不符的文献的高人啊？推荐文献看一下好吗？
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发表于 2014-6-19 10:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
附上电泳图，请大家帮忙啊


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2014-6-19 10:37
25118438.jpg (22.4 KB)
 
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发表于 2014-6-19 12:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是差了10kD，不是大了10kD，上面写错了啊！
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发表于 2014-6-19 12:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做一下wb
用特异性抗体验证一下就行了
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发表于 2014-6-19 12:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

WB做过的，确实是我要的GST融合蛋白，但是为什么分子量大小不对头，有这样的情况出现吗？我想找些文献里的相关说明，有高人看过吗？
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发表于 2014-6-19 12:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

只是从SDS-PAGE上看分子量是不大准的，因为大分子的marker并不是迁移距离和分子大小呈线性的。你的目的条带只能说是在6万6和9万7之间，没法说是7万或者8万，所以还需要更精确的手段确定分子量的。可以用和你的蛋白大小相似的已知蛋白来做个marker或者用分子筛跑标准蛋白。
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发表于 2014-6-19 12:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先，SDS-PAGE电泳时分子量marker不能作为绝对标准，只是一个参考值。
其次，有的蛋白（如组蛋白和一些易形成dimer的蛋白，还有一些比较难变性而又形成紧凑的球形结构的蛋白）在用常规方法电泳时会出现异常行为（表观分子量与实际分子量不符）。
您可以用关键词：anomalous electrophoresis behavior搜一下。
比如：下面的几篇文章都或多或少提到这一现象。至于很详细的解释一般是1950年左右的文献，不好找。您可以参考下面的文献，结合您的蛋白特性分析一下：
1 很多公司关于组蛋白的产品介绍，有引用文献。
2 Evidence for Sodium Dodecyl Sulfate/Protein Complexes Adopting a Necklace Structure
  M. Samsó, J.R. Daban, S. Hansen i G.R. Jones
  Eur. J. Biochem. 232 (1995) 818 824.
3 Molecular Biology of the Cell
Vol. 14, 4758–4769, December 2003
Glom Is a Novel Mitochondrial DNA Packaging Protein in Physarum polycephalum and Causes Intense Chromatin Condensation without Suppressing DNA Functions
4 INFECTION AND IMMUNITY, Dec. 2002, p. 6976–6986 Vol. 70, No. 12
0019-9567/02/$04.000 DOI: 10.1128/IAI.70.12.6976–6986.2002
Expression of a Novel Leishmania Gene Encoding a Histone H1-Like Protein in Leishmania major Modulates Parasite Infectivity In Vitro
若您在检索上述文献时存在困难，请到SOS求助或pm给我。
希望您能找到答案。
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发表于 2014-6-19 12:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1,以前对于这个问题,似乎听实验室的师兄说,SDS-PAGE鉴定表达的外原蛋白,分子量和Marker有一定的出入,一般在10kD左右浮动还是可以接受的,也许就是你所遇到的这种情况.不过最终的结果还是要看你的WB结果了;
2,也许有可能是你的蛋白表达过程中提前终止,那就没有办法,只有更换载体;
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发表于 2014-6-19 12:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

就 楼上战友的回答跟大家讨论一下，不知道对不对，请指正。
“1,以前对于这个问题,似乎听实验室的师兄说,SDS-PAGE鉴定表达的外原蛋白,分子量和Marker有一定的出入,一般在10kD左右浮动还是可以接受的”
这个可能是说一般大10kD左右比较正常吧。因为有的原核表达载体带有较长的tag，这些tag有的是助溶tag，有的是方便纯化（如his）。有的载体N端tag加起来有100多氨基酸，就是10kD左右了。一般来说在纯化后要用一些蛋白酶把这些tag去掉。当然C端的tag如果不要的话可以自己加终止密码子去掉。
“2,也许有可能是你的蛋白表达过程中提前终止,那就没有办法,只有更换载体;”
可能 虚 战友的意思是重新构建吧，提前终止应该不是载体的原因。
最近要写论文了，在这里抛砖引玉，希望能学到一些知识，丰富文章的讨论。。。
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gmjghh[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上战友提到的提前中止我已经查过了，使用的载体是pGEX-4T-1，插入片段中没有中止密码子，使用的载体上的中止子，应该没有提前中止。以前好像在论坛里看到有战友提到SDS-PAGE中蛋白的分子量与标准之间可以相差10％这样的说法， 不知道大家还记得不？也不知道这一说法的根据是什么？
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