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标题:【求助】大家帮忙分析一下2DE图

mogu[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】大家帮忙分析一下2DE图


各位大虾：
这是我前几天做的双向的图.
材料是从猪肺脏中灌出来的肺泡巨噬细胞(可以认为是培养细胞)
用的是7CM胶条，135ul/70ug.
裂解液成分为：10M Tris 5M尿素 2M硫脲 2%CHAPS 2% SB3-10 现加2mMTBP和0.5%TPG BUFFER。
重泡胀液、平衡液均为常规配方
采用BIO-RAD等电聚焦，主动水化，程序采用BIO-RAD推荐程序：
水化 50V 12小时
S1 250V 线性 30分钟
S2 500V 快速 30分钟
S3 4000V 线性 3小时
S4 4000V 线性 20000伏小时
平衡和二向均为常规方法
染色采用银染
请大家帮忙!谢谢！
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

将裂解液中尿素的浓度提高可为7M
水化时间再延长，聚焦可以30000VHS
上样前高速离心
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mogu[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢!
你觉得裂解液中尿素浓度会对最后的图形产生影响吗？
水化时间到可以延长看看，聚焦30000vhs对于7CM胶条会不会太高了？上样前高速离心是可以试试！
真心希望各位高手提出宝贵意见，小弟在这里谢过了！
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

聚焦效果还可以，但是染色时间过长。中间黑的一团可能是背景不干净的原因
上样量偏大。
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发表于 2014-6-19 12:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先是上样量太大了，我跑18cm的胶条一般就上样80-100ug，7cm的胶条建议你用40-50ug。上样量大，虽然点的信息多，但背景高，特别是银染的干扰大。
此外，水化时间12小时是可以的，但可适当提高一点聚焦的总伏小时数。
胶左上方背景尤其高，应该考虑一下除核酸。
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

提几点建议，希望对楼猪有帮助！
1.TBP虽然是不带电的还原剂，效果并不是很好，而且其半衰期很短，我做过对照实验，TBP的效果并不比DTT好多少，当然我们做的实验不同，如果是针对碱性蛋白，最好用Amersham公司的DeStreak还原剂，效果很好。
2.上样量大了点，以及聚焦时间可稍微延长，楼上都提到了。
3.严格控制银染时间，要眼明手快！
4.注意染盘要干净，以及水的质量，手接触胶不要用力，特别是银染时，避免留下你的手印在胶上。
5.还有你的样本自身问题，考虑用试剂盒。
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mogu[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位：
首先感谢大家的帮助，我又作了一次双向，作了以下几个方面的改进：
1.减少上样量：35ug
2.将细胞于-80度反复冻融了2次，然后加入核酸酶作用5分钟，再加裂解液13度作用1小时
3.用50mmol/L DTT替代TBP
4.泡胀时间从12小时延长到14小时
5.聚焦从20000VH延长到30000VH
6.对于转移，采用先加琼脂糖液再加胶条的方法
7.用三蒸水配制PAGE胶及电泳缓冲液
结果从实物图中能看到更多点了，应该总体来说有进步，但是还是有不少问题，希望大家多提建议，小弟在这里谢过了！
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

银染时间还是长了点，背景不干净，可能胶上沾了杂质。
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是否可以将样品用cleanup试剂合试一试。
升亚是否困难，可不可以降电压提高一些
感觉DTT浓度还是地
我用的是100mM的
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gemei0115[使用道具]
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发表于 2014-6-19 12:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看了你的2-D图.好像进步不是很明显!
1.样本存在问题,细胞纯不纯?是不是含有其他东西(比如培养基)?非细胞成分一定尽量去得干净!
2.核酸酶有没有问题,感觉你的胶的背景很脏,蛋白纯度不高!
3.不知是没有扫描好,还是胶本身的样子,感觉你的SDS-PAGE胶没有做好,这里要考虑你做胶的试剂的"有效期".
4.琼脂糖的质量有问题没?琼脂糖的质量能影响到胶的背景.
5.转移胶条时,有没有损伤胶条?
6.聚焦时间还可延长点.如果升压困难,如果聚焦过程中电流强度过高,那就要考虑到样品中的盐离子浓度过高,要去盐.
楼上提到的2-D clean up 试剂盒确实不错,我也用过.好像1000多吧,顶多2000左右,不太记得了.不过也不要盲目购买.
实验过程要仔细,多思考,从处理细胞开始找出最终2-D效果不理想的可能原因,找到问题的关键!
有问题继续讨论!祝楼猪好运!
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